DAPK和FHIT基因启动子甲基化检测在血液系统肿瘤中的意义

摘要

目的： 研究造血系统肿瘤骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)、急性髓细胞性白血病(acute myeloid leukemia，AML)和慢性髓细胞性白血病(chronic myeloid Leukemia，CML)患者中死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase，DAPK)和脆性组氨酸三联基因(fragile histidine triad，FHIT启动子区域的甲基化状况及其临床相关性。 方法： 建立甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MSP)技术并对59例不同阶段MDS患者、112例AML患者和49例CML患者骨髓标本的DAPK基因甲基化状态进行检测，对54例不同阶段MDS患者骨髓标本的FHIT基因甲基化状态进行检测，分析DAPK和FHIT基因甲基化状态与患者的临床相关性。 结果： 59例MDS患者中37例(62.7％)发生DAPK基因甲基化，DAPK基因甲基化改变与患者的年龄、血象、染色体异常等结果均无相关性，但与患者性别、骨髓原始细胞比例具有显著的相关性(R值分别为0.332和0.346，P值分别为0.010和0.010)。DAPK基因甲基化频率在难治性贫血(refractory anemia，RA) (2/5例，40.0％)、伴多系病态造血的难治性血细胞减少症(refractory cytopeniawith multilineage dysplasia，RCMD)和伴环形铁粒幼细胞的RCMD(refractory cytopenia with multilineage dysplasia with ringed blasts，RCMD-RS)(12/22例，54.5％)、难治性贫血伴有原始细胞增多-1型(refractory anemia with excess blasts-1，RAEB-1)(8/10例，80.O％)、难治性贫血伴原始细胞增多-2型(refractory anemia with excess blasts-2，RAEB-2)(9/11例，81.8％)、难治性贫血伴有原始细胞增多转化型/急性髓细胞性白血病(refractory anemia with excess blasts in transformation/acute myeloid leukemia，RAEBt/AML)(6/8例，75.O％)和5q-综合征(0/3例，O％)之间的差异无统计学意义(x2=10.288，P=O.067)，但5q-综合征、原始细胞正常组(RA/RCMD)和原始细胞增高组(RAEB-l/RAEB-2/AML)之间的差异具有统计学意义(x2=9.824，p=O.007)，并且IPSS中高危组(Int-1/Int-2/High)患者中DAPK甲基化频率明显高于低危组(Low)(分别为35/51例和1/7例，p=0.010)。 112例AML患者中82例(73.2％)发生DAPK基因甲基化，DAPK基因甲基化改变与患者的性别、年龄、白细胞、血红蛋白、血小板计数、染色体异常类型等结果均无相关性(p＞0.05)。AML各亚型中的DAPK基因甲基化频率分别为66.7％(14/21例，M1)、72.5％(29/40例，M2)、69.2％(9/13例，M3)、90.O％(18/20例，M4)、66.7％(8/12例，M5)、66.7％(4/6例，M6)，DAPK甲基化频率与AML分型之间无相关性(p＞O.05)。 49例CML患者中25例(51.O％)发生DAPK基因甲基化，DAPK基因甲基化改变与患者的年龄、白细胞、血红蛋白、血小板计数、染色体异常类型等结果均无相关性(P＞O.05)，但与患者的性别具有显著的相关性(R=O.374，P=O.008)。BAPK基因甲基化频率与CML分期之间具有显著的相关性(R=0.354，P=0.013)，甲基化频率在CML各期之间的差异具有统计学意义(x2=8.659，P=0.013)，加速期和急变期患者中DAPK基因甲基化频率明显高于慢性期患者(x2=7.776，P=0.005)。 54例MDS患者中26例(48.1％)发生FHlT基因甲基化，FHIT基因甲基化改变与患者的性别、血象、染色体异常等结果均无相关性，但与患者年龄具有显著的相关性(R=0.291，P=0.033)。FHIT基因甲基化频率在难治性贫血/伴有环形铁粒幼细胞的难治性贫血(RA/RARS)(1/6例，16.7％)、RCMD和RCMD-RS(6/19例，31.6％)、RAEB-1(7/11例，63.6％)、RAEB-2(4/7例，57.1％)和RAEBt/AML(8/11例，72.7％)之间的差异无统计学意义(x2=8.417，p=0.077)，但早期阶段(RA/RARS和RCMD)、晚期阶段(RAEB-1和RAEB-2)以及RAEBt/AML患者之间的差异具有统计学意义(x2=7.938，p=0.019)，并且FHIT丁基因甲基化频率与IPSS分组预后危险程度也具有显著的正相关性(x2=10.110，P=0.018)。 结论： DAPK基因甲基化可能是促进造血系统肿瘤MDS、AML和CML发生发展的分子事件之一；FHIT基因甲基化可能是促进MDS疾病进展的分子事件之一；并且是MDS患者预后不良的一个影响因素。

目录

文摘

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论文说明：英文缩略语

声明

第一章绪论

1.1常见造血系统肿瘤中的甲基化状况

1.1.1急性髓细胞白血病(AML)

1.1.2慢性髓细胞白血病(CML)

1.1.3骨髓增生异常综合征(MDA)

1.1.4淋巴系统肿瘤

1.2展望

第二章本论文研究的目的、方法、实验方案的设计、意义

2.1研究目的

2.2研究方法及技术

2.2.1 MSP的引物设计原理

2.2.2 MSP的引物设计注意要点

2.2.3 FHIT基因和DAPK基因的MSP引物

2.3实验方案的设计

2.4本研究的意义

第三章髓系肿瘤患者DAPK基因启动子甲基化改变的研究

3.1材料和仪器

3.1.1材料

3.1.2试剂

3.1.3主要仪器

3.2方法

3.2.1骨髓单个核细胞分离和DNA制备（Genomic DNA Purification Kit）

3.2.2 DNA修饰(CpGenomeTMDNA Modification Kit 修饰DNA)

3.2.3 DAPK基因甲基化检测

3.2.4 PCR产物回收与纯化

3.2.5重组载体构建

3.2.6重组质粒转化

3.2.7重组质拉提取

3.2.8质粒鉴定、测序

3.2.9细胞遗传学检查

3.2.10统计

3.3结果

3.3.1 MDS患者中DAPK基因甲基化结果

3.3.2MSP检测 AML患者中DAPK基因甲基化结果

3.3.3MSP检测 CML患者中DAPK基因甲基化结果

3.3.4MSP检测正常对照中DAPK基因甲基化结果

3.4讨论

第四章MDS患者FHIT基因启动子甲基化改变的研究

4.1材料和仪器

4.2方法

4.3结果

4.3.1 MDS患者中FHIT基因甲基化频率

4.3.2 FHIT基因甲基化频率与MDS亚型的关系

4.3.3 Kaplan-Meier生存分析

4.4讨论

第五章结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的文章