集胞藻PCC6803染色体上毒素-抗毒素系统ssl2138/sll1092的研究

摘要

细菌的毒素-抗毒素系统(Toxin-antitoxin,TA system)最早发现于低拷贝细菌质粒上,其作用是维持质粒在宿主细胞中的稳定性。通常由毒素基因和抗毒素基因构成,根据抗毒素基因编码产物的的生化本质,可分为RNATA系统(Ⅰ型TA系统)和蛋白TA系统(Ⅱ型TA系统)。Ⅱ型TA系统也广泛存在于细菌染色体上,毒素基因和抗毒素基因共同表达并分别编码毒素和抗毒素蛋白；毒素和抗毒素蛋白可以相互作用形成复合体,这种复合体或抗毒素蛋白都能与其启动子上的调控序列结合,反馈抑制操纵子的转录；抗毒素可被依赖ATP的蛋白酶降解,因此是不稳定的蛋白。迄今,除少数细菌染色体上的TA系统的生理功能得以证明,如大肠杆菌染色体上的relBE和mazEF系统可介导环境胁迫诱导的生长抑制或细胞死亡,多数TA系统的功能尚不清楚。蓝藻是广泛分布并能应对各种环境胁迫的真细菌,其染色体上也存在大量的TA系统基因,生物信息学分析显示单细胞蓝藻集胞藻PCC6803染色体上至少有30对TA系统,但其生理功能和生化遗传特征尚不清楚。此前,本实验室已初步证明ssl2138／sll1092可能构成一对TA系统,ssl2138为抗毒素基因,sll1092为毒素基因。本文对该TA系统进行了如下研究:
　　 1)在大肠杆菌中诱导ssl2138／sll1092共表达,借助亲和捕捉技术共纯化重组蛋白,通过肽谱分析共表达产物Ssl2138和Sll1092,证明它们之间相互作用形成复合体；
　　 2)通过基因敲除技术构建ssl2138／sll1092缺失突变株DR649,以抑制细菌蛋白质合成的壮观霉素和过氧化氢作为诱导剂,分析缺失突变株的表型,初步确定ssl2138／sll1092基因在胁迫条件下的生理功能；
　　 3)通过构建由铜离子诱导sll1092和ssl2138／sll1092共表达的诱导表达突变株,分析ssl2138／sll1092系统基因编码产物的生物活性；
　　 4)以LacZ为报告基因,构建ssl2138／sll1092系统的各种表达调控突变株,通过测定不同表达调控突变株中报告基因的表达,揭示ssl2138／sll1092系统的表达调控方式；
　　 5)利用大肠杆菌选择性表达系统,分别将蛋白酶基因和毒素-抗毒素(或抗毒素)基因置于启动子PT7和PBAD控制下,在大肠杆菌中选择性诱导表达蛋白酶Lons或ClpP2s／Xs以及Ssl2138／sll1092,通过细胞生长特征分析以及蛋白质免疫印迹(Western blot)证明集胞藻PCC6803中的蛋白酶Lons和ClpPs2对Ssl2138抗毒素蛋白的降解。
　　 通过上述研究得到以下结论:
　　 1)ssl2138编码的抗毒素蛋白Ssl2138和ssll092编码的毒素蛋白Ssl1092在体内相互作用形成复合体,抑制毒素蛋白的细胞毒性作用。
　　 2)ssl2138／sll1092基因的缺失导致细胞对蛋白合成抑制型抗生素的敏感性增加,但对过氧化物的敏感性不变。表明ssl2138／sll1092可能与环境胁迫因素诱导蛋白质合成抑制所致的细胞死亡或生长抑制有关。
　　 3)抗毒素Ssl2138和Ssl2138／Sll1092复合体都能反馈抑制其操纵子的转录,而Ssl2138／Sll1092复合体的反馈抑制作用更强。
　　 4)集胞藻PCC6803中的蛋白酶Lons和ClpP2s／Xs都能降解毒素-抗毒素复合体中的抗毒素蛋白Ssl2138,并激活毒素Sll1092的细胞毒性作用。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1.1 细菌毒素-抗毒素系统

1.1.1 细菌TA系统的分类

1.1.2 TA系统的多样性和进化

1.1.3 细菌质粒上的TA系统

1.1.4 细菌染色体上的FA系统

1.2 TA系统毒素蛋白的结构和作用机制

1.2.1 毒素的结构分析

1.2.2 毒素蛋白的作用机制

1.3 TA操纵子的表达调控

1.3.1 抗毒素的DNA结合模式。

1.3.2 典型的二元TA操纵子的转录调控。

1.3.3 毒素和抗毒素的比例可能调控TA操纵子的的转录。

1.4 TA系统的生物学作用

1.4.1 应对胁迫

1.4.2 防止DNA的丢失

1.4.3 防止外源DNA的侵入

1.5 细菌中依赖ATP的蛋白酶系统

1.5.1 Lon蛋白酶

1.5.2 Clp蛋白酶

1.5.3 蓝藻中的ClpP蛋白酶系统

1.6 本研究的目的和思路

第二章 ssl2138/sll1092系统毒素和抗毒素蛋白的相互作用

2.1 实验材料和方法

2.1.1 质粒、菌株和培养条件

2.1.2 分子生物学操作

2.1.3 蓝藻PCC6803染色体的提取

2.1.4 重组蛋白的诱导表达和检测

2.1.5 重组蛋白的纯化

2.1.6 重组蛋白的质谱分析

2.2 结果

2.2.1 ssl2138和ssl2138/sll1092诱导表达菌株的构建及鉴定

2.2.2 H6-Ssl2138和H6-Ssl2138/Sll1092重组蛋白的纯化及检测

2.2.3 重组蛋白的质谱分析

2.3 讨论

第三章 缺失突变株和诱导表达调控突变株的生理特征

3.1 实验材料和方法

3.1.1 菌株、培养条件

3.1.2 分子生物学操作

3.1.3 集胞藻PCC6803的转化及转化子的筛选

3.1.4 缺失突变藻株的表型分析

3.1.5 Cu2+诱导表达调控突变株的方法

3.2 结果

3.2.1 ssl2138/sll1092缺失突变株的构建及鉴定

3.2.2 缺失突变株DR649的表型分析

3.2.3 以PpetEs为启动子的鼋组质粒的构建及鉴定

3.2.4 Cu2+诱导表达调控突变株的表型分析

3.3 讨论

第四章 ssl2138/sll1092系统的表达调控研究

4.1 实验材料和方法

4.1.1 菌株、培养条件和分子生物学操作

4.1.2 β-半乳糖苷酶活性的测定

4.2 结果

4.2.1 以LacZ为报告基因的表达调控重组质粒的构建及鉴定

4.2.2 大肠杆菌中β-半乳糖苷酶活性的测定

4.2.3 表达调控突变藻株中β-半乳糖苷酶活性的测定

4.3 讨论

第五章 蛋白酶对抗毒素蛋白的降解作用

5.1 实验材料和方法

5.1.1 菌株、培养条件和分子生物学操作

5.1.2 选择性表达菌株的诱导

5.1.3 多克隆抗体的制备

5.1.4 抗体效价检测和Western blot分析

5.2 结果

5.2.1 选择性表达TA系统和蛋白酶基因质粒的构建

5.2.2 Ssl2138和Sll1092多克隆抗体的检测

5.2.3 蛋白酶降解抗毒素蛋白的Western blot检测

5.2.4 蛋白酶对ssl2138/sll1092系统的激活作用

5.3 讨论

第六章 结论与展望

6.1 主要结论

6.2 研究展望

参考文献

附录Ⅰ缩略语表

附录 Ⅱ 主要实验仪器

附录 Ⅲ 主要试剂及配制

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文