集胞藻PCC6803染色体上毒素—抗毒素系统vapBC10与vapBC12的研究

摘要

典型的毒素-抗毒素系统（Toxin-Antitoxin system，TA系统）由位于同一操纵子中的两个基因组成。其中，一个基因编码稳定的毒素蛋白、具有细胞毒性作用，另一个基因编码不稳定的抗毒素蛋白。TA系统在原核生物中分布广泛，其中vapBC是目前发现的TA系统家族中最大的家族。操纵子中两个相邻或重叠的基因分别编码抗毒素蛋白(VapB)和PIN结构域的毒素(VapC)。抗毒素VapB与毒素VapC相互作用形成一个无细胞毒性的蛋白质复合体，并通过VapB的N-末端的DNA结合结构域与TA操纵子调控序列结合，反馈调控vapBC转录。在一些细菌基因组中，有编码COG2442-PIN结构域的遗传位点，尤其是蓝细菌和绿弯菌中数量最多。集胞藻PCC6803染色体上编码至少16个vapBC位点，其中vapBC10(ssr2962/slr1767)和vap BC12（ssl2733/sll1400）构成编码含COG2442-PIN结构域的vapBC家族的TA系统，但这类TA系统的生理功能还不清楚。本文对集胞藻PCC6803染色体上vapBC10和vapBC12 TA系统及其生理功能进行研究，主要内容包括:
　　(1)以大肠杆菌单杂交系统和选择性表达系统，研究vapBC10和vapBC12编码产物在转录水平和蛋白水平上的交互调控作用，以及对上下游相邻基因的转录调控作用。
　　(2)构建vapBC10和vapBC12的缺失突变株，分析它们在Cd和H2O2等胁迫条件下的生长表型，确定它们可能的生理功能。
　　(3)构建vapBC10和vapBC12系统组分分别表达或过表达突变株，分析这些突变株在Cd和H2O2胁迫条件下的生长表型，证明TA系统基因在集胞藻细胞适应环境胁迫中的生理功能。
　　研究得到以下结论:
　　(1)lacZ报告基因与vapBC10和vapBC12的融合转录分析表明，与已报道的典型TA系统反馈调控特征不同，抗毒素VapB10具有转录激活作用，而毒素蛋白VapC10具有抑制VapB10的转录激活作用;抗毒素VapB12或毒素-抗毒素复合体VapB12-VapB12对启动子PvapBC12无明显反馈调控作用。大肠杆菌单杂交分析结果表明vapBC10和vapBC12编码的抗毒素或毒素-抗毒素复合体对异源TA系统启动子没有转录调控作用，对上下游相邻基因的转录也无调控作用。
　　(2)大肠杆菌选择性表达系统分析结果表明，抗毒素VapB12不能抑制异源毒素VapC10的细胞毒性，抗毒素VapB10不能抑制异源毒素VapC12的细胞毒性，vapBC10和vapBC12编码的毒素抗毒素在蛋白水平上也没有交互调控作用。
　　(3)对vapBC10和vapBC12系统缺失突变株、含lacZ基因的转录调控突变株和受铜离子诱导的过表达突变株的生长表型分析表明，vapBC10和vapBC12与细胞正常条件下的生长无关。vapBC10参与集胞藻细胞适应Cd和H2O2胁迫，其中VapB10在集胞藻细胞适应Cd胁迫中具有重要作用;但vapBC12与集胞藻细胞适应Cd胁迫无关。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 毒素-抗毒素系统

1．1．1 TA系统概述

1．1．2 TA系统的分类

1．1．3 TA系统的生理功能

1．2 vapBC(Virulence associated protein)TA系统

1．2．1 PIN结构域概述

1．2．2 vapBC TA系统特征

1．2．3 原核生物中vapBC的分布

1．3 蓝细菌

1．3．1 蓝细菌概述

1．3．2 集胞藻PCC 6803(Synechocystis sp． PCC 6803)的特征

1．3．3 集胞藻PCC 6803染色体上的TA系统

1．3．4 集胞藻PCC 6803染色体上的COG2442-PIN遗传位点构成的vapBCTA系统

1．4 本研究的目的和意义

第二章 vapBC10和vapBC12系统在异源宿主大肠杆菌细胞中的交互调控作用

2．1 材料和方法

2．1．1 分子生物学操作方法

2．1．2 菌株培养条件

2．1．3 vapBC10和vapBC12转录交互调控大肠杆菌重组菌株的构建方法

2．1．4 vapBC10和vapBC12活性交互调控大肠杆菌重组菌株的构建方法

2．1．5 vapBC10和vapBC12在转录水平上的交互调控分析

2．1．6 vapBC10和vapBC12在蛋白水平上的交互调控分析

2．1．7 vapBC10和vapBC12序列和二级结构分析

2．1．8 数据分析

2．2 结果

2．2．1 vapBC10和vapBC12与lacZ融合转录报告质粒的构建

2．2．2 vapBC10和vapBC12系统转录的反馈调控

2．2．3 vapBC10和vapBC12系统在转录水平上的交互调控

2．2．4 vapBC12编码产物对其上下游基因sl1398、sll1399和sll1401的转录调控

2．2．5 vapBC10和vapBC12系统在蛋白水平上的交互调控作用

2．3 讨论

第三章 毒素-抗毒素系统基因vapBC10和vapBC12缺失突变株在不同培养条件下生长表型分析

3．1 实验材料和方法

3．1．1 分子生物学操作方法

3．1．2 菌株和藻株培养条件

3．1．3 集胞藻PCC 6803的转化及转化子的筛选

3．1．4 集胞藻PCC 6803及突变株染色体的提取方法

3．1．5 缺失突变株的表型分析方法

3．2 结果

3．2．1 vapBC10和vapBC12基因的缺失突变重组质粒的构建

3．2．2 vapBC10和vapBC12基因的缺失突变株的构建

3．2．3 缺失突变株DR1377和DR948的表型分析

3．3 讨论

第四章 vapBC10和vapBC12组分在细胞适应Cd和H2O2胁迫中的作用

4．1 实验材料和方法

4．1．1 分子生物学操作方法

4．1．2 菌株和藻株培养条件

4．1．3 vapBC10和vapBC12转录调控突变株的生长特性分析

4．1．4 vapBC10和vapBC12组分过表达突变株的生长特性分析

4．2 结果

4．2．1 vapBC10和vapBC12组分表达对集胞藻适应Cd和H2O2的影响

4．2．2 vapBC10组分过表达对集胞藻适应Cd和H2O2的影响

4．3 讨论

第五章 结果与展望

5．1 结果

5．2 研究展望

参考文献

致谢

在学期间发表的学术论文

附录

附录A 缩略语

附录B 主要实验仪器

附录C 主要试剂及配制

附录D 主要试剂