集胞藻PCC6803染色体上毒素-抗毒素系统ssl420/sll1225与ssl2749/sll1411的研究

摘要

细菌的毒素-抗毒素系统(Toxin-antitoxin，TAsystem)由毒素基因和抗毒素基因构成。广泛存在于细菌染色体上的TA系统可能与细菌适应环境胁迫有关。细菌适应环境胁迫的策略之一是降低生长速度或使细胞处于休眠状态，从而降低细胞的新陈代谢速度以及能量消耗。在适宜的环境条件下便于细胞迅速恢复生长。但迄今，仅少数细菌的中部分TA系统在适应环境胁迫中的生理作用得到证明。蓝藻作为地球上最古老的生物之一，广泛分部于不同生境中。在长期的自然选择过程中，进化出极强的环境适应能力。蓝藻基因组中也存在大量的TA系统，但它们在蓝藻适应环境胁迫中的作用有待证明。生物信息技术分析表明，集胞藻PCC6803染色体上存在34个公认的TA系统，但它们的生理功能还不清楚。本文对集胞藻PCC6803染色体上由ssl2420/sll1225和ssl2749/sll1411分别构成vapBC和mnt/hepn家族TA系统进行研究，内容包括:
　　 1)通过基因敲除构建ssl2420/sll1225缺失突变株DR1270和ssl2749/sll1411缺失突变株DR1267，分析在温度、壮观霉素以及过氧化氢胁迫条件下缺失突变株的生长表型;构建受铜离子诱导ssl2420/sll1225和ssl2749/sll1411基因表达的表达突变株，分析这些基因的表达产物对集胞藻生长的影响。
　　 2)将集胞藻PCC6803染色体上的蛋白酶基因lons或clpP2s/Xs和毒素-抗毒素或者单独抗毒素基因分别置于PT7与PBAD控制下，分析蛋白酶和TA系统表达产物对大肠杆菌生长的影响，以及蛋白酶对ssl2420/sll1225与ssl2749/sll1411TA系统的激活作用;通过蛋白质免疫印记(Westernblot)方法证明蛋白酶Lons或ClpP2s/Xs对抗毒素蛋白的降解作用。
　　 3)在大肠杆菌中诱导ssl2420/sll1225共表达，利用亲和捕捉技术证明ssl2420/sll1225TA系统编码的抗毒素蛋白和毒素蛋白之间能够相互作用形成复合体。
　　 4)以lazZ为报告基因，构建ssl2749/sll1411融合转录重组质粒或构建ssl2420/sll1225单杂交重组质粒。通过重组菌株中报告基因表达产物的催化活性，确定ssl2749/sll1411与sl2420/sll1225两对TA系统在转录水平上反馈调控作用。
　　 本研究得到以下结果和结论:
　　 1)ssl2420/sll1225和ssl2749/sll1411的缺失导致集胞藻PCC6803在抗生素壮观霉素或过氧化氢胁迫条件下的生长速度一定程度下降，而在不同温度胁迫下蓝藻生长速度无明显变化。诱导毒素基因sll1225和sll1411过表达可降低集胞藻在正常条件下的生长速度。提示ssl2420/sll1225和ssl2749/sll1411TA系统可能通过调控细胞生长速度，使蓝藻适应蛋白质合成抑制和氧化胁迫。
　　 2)集胞藻PCC6803蛋白酶Lons或ClpP2s/Xs基因与ssl2420/sll1225TA系统基因表达，不影响大肠杆菌细胞生长;但Lons或ClpP2s/Xs基因与ssl2749/sll1411同时表达时抑制大肠杆菌生长。Westernblot分析结果表明Lons或ClpP2s/Xs可降解抗毒素Ssl2420。提示Lons或ClpP2s/Xs通过降解抗毒素Ssl2420可激活ssl2420/sll1225TA系统，使细菌生长受到抑制，但是否存在可降解ssl2749/sll1411TA系统编码的抗毒素尚需进一步研究。
　　 3)在ssl2420/sll1225TA系统中，抗毒素Ssl2420与毒素Sll1225在体内相互作用形成复合体，表明抗毒素与相应的毒素相互作用拮抗毒素的生长抑制作用。
　　 4)转录调控分析结果表明ssl2420/sll1225和ssl2749/sll1411TA系统的启动子都具有转录激活作用。抗毒素Ssl2749可激活启动子Pssl2749的转录活性，Sll1411抑制Ssl2749的转录激活作用;Ssl2420对启动子Pssl2420有正反馈调控作用，但毒素Sll1225可一定程度上抑制这种调控作用。

目录

声明

摘要

第一章 文章综述

1．1 细菌的毒素-抗毒素系统

1．1．1 细菌TA系统的分类

1．1．2 细菌染色体上Ⅱ型TA系统的作用机制

1．1．3 Ⅱ型TA系统的生理功能

1．2 细菌中依赖ATP的蛋白酶系统

1．2．1 Lon蛋白酶

1．2．2 Clp蛋白酶的结构及特征

1．2．3 蓝藻中的Clp蛋白酶系统

1．3 本研究的目的和思路

第二章 缺失突变株DR1267与DR1270以及相关表达调控突变株的生理特性

2．1 实验材料和方法

2．1．1 菌株、培养条件

2．1．2 分子生物学操作

2．1．3 集胞藻PCC6803的转化及转化子的筛选

2．1．4 缺失突变藻株DR1270与DR1267的表型分析

2．1．5 Cu2+诱导表达调控突变株的方法

2．2 结果

2．2．1 ssl2420／sll1225与ssl2749／sll1411缺失突变株的构建及鉴定

2．2．2 缺失突变株DR1270与DR1267的表型分析

2．2．3 以PpetEs为启动子的重组质粒的构建及鉴定

2．2．4 Cu2+诱导表达调控突变株的表型分析

2．3 讨论

第三章 ssl2420／sll1225系统毒素蛋白和抗毒素蛋白的相互作用

3．1 实验材料和方法

3．1．1 菌株、质粒和培养条件

3．1．2 分子生物学操作

3．1．3 蓝藻PCC6803染色体的提取

3．1．4 重组蛋白的诱导表达和检测

3．1．5 重组蛋白的纯化

3．2 结果

3．2．1 毒素-抗毒素基因ssl2420／sll1225诱导表达菌株的构建及鉴定

3．2．2 H6-Ssl2420／Sll1225重组蛋白的纯化及检测

3．3 讨论

第四章 蛋白酶对集胞藻PCC6803中的抗毒素蛋白的降解作用

4．1 实验材料和方法

4．1．1 菌株、培养条件和分子生物学操作

4．1．2 选择性表达菌株的诱导

4．1．3 多克隆抗体的制备

4．1．4 抗体效价检测和Western blot分析

4．2 结果

4．2．1 蛋白酶基因质粒与选择性表达TA系统基因质粒的构建

4．2．2 蛋白酶对ssl2420／sll1225与ssl2749／sll1411系统的激活作用

4．2．3 Ssl2420和Sll1225多克隆抗体的检测

4．2．4 蛋白酶降解抗毒素蛋白的Western blot检测

4．3 讨论

第五章 ssl2420／sll1225与ssl2749／sll1411系统的转录调控研究

5．1 实验材料和方法

5．1．1 菌株、培养条件和分子生物学操作

5．1．2 β-半乳糖苷酶活性的测定

5．2 结果

5．2．1 以lacZ为报告基因的表达调控重组质粒的构建及鉴定

5．2．2 大肠杆菌中β-半乳糖苷酶活性的测定

5．3 讨论

第六章 主要结论与展望

6．1 主要结论

6．2 研究展望

参考文献

附录Ⅰ 缩略语表

附录Ⅱ 主要实验仪器

附录Ⅲ 主要试剂及配制

致谢

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