腺病毒载体介导的人Nanog基因修饰人脐带间质干细胞的研究

摘要

目的：构建人Nanog基因重组腺病毒载体(Ad—Nanog),转染人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSCs),检测nanog基因在hucMSCs中的表达,研究Nanog基因修饰对hucMSCs的生物学特性影响,希望能促进hucMSCs维持自我更新能力及多向分化潜能,为基因修饰hucMSCs的后继研究提供实验基础。
　　 方法：设计含有KpnⅠ及XhoⅠ酶切位点的引物,PCR扩增Nanog,将扩增产物亚克隆到pAdTrack-CMV穿梭质粒上,经双酶切和基因测序鉴定,重组穿梭质粒经PineⅠ线性化后,在含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中同源重组,筛选获得Ad-Nanog重组腺病毒质粒,经PacⅠ酶切线性化,脂质体转染293A细胞,包装和扩增病毒,并感染hucMSCs。通过免疫组织化学,Western blot检测Nanog在hucMSCs中的表达及亚细胞定位；MTT、平板克隆实验检测Nanog修饰对hucMSCs增殖和克隆形成能力的作用；提取细胞的总RNA,并逆转录成cDNA,检测干细胞相关基因的表达情况；裸鼠致瘤实验评价Nanog修饰hucMSCs的生物安全性。
　　 结果：重组腺病毒质粒经PCR和Xho1及Kpn1酶切鉴定正确,测序结果和设计片段的序列一致。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在感染的hucMSCs中高效表达。Nanog基因修饰促进hucMSCs的增殖,克隆形成,成骨分化。
　　 结论：成功构建了Nanog腺病毒表达载体,能高效转染hucMSCs,Nanog基因修饰改善了hucMSCs部分干细胞特性,为转基因修饰hucMSCs的研究奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 Nanog基因的发现

1.2 Nanog基因结构及转录

1.3 Nanog基因的功能

1.4 Nanog基因的表达与调控

1.5 间质干细胞

1.6 脐带间质干细胞

1.6.1 脐带间质干细胞的应用

1.6.2 基因修饰脐带间质干细胞的应用

第二章 研究目的、方法、实验设计方案和意义

2.1 研究目的

2.2 研究方法

2.3 实验设计方案

2.4 研究意义

第三章 Nanog腺病毒表达载体的构建

3.1 材料及仪器

3.1.1 材料试剂

3.1.2 主要仪器

3.2 方法

3.2.1 PCR引物设计

3.2.2 目的基因的克隆

3.2.3 重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-Nanog的构建与鉴定

3.2.4 重组腺病毒质粒pAd-Nanog的构建及鉴定

3.2.5 293A细胞的复苏和培养

3.2.6 重组腺病毒Ad-Nanog的转染包装及扩增

3.2.7 重组腺病毒Ad-Nanog滴度的测定

3.3 结果

3.3.1 人Nanog基因的克隆

3.3.2 重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-Nanog的鉴定

3.3.3 重组腺病毒质粒pad-Nanog的鉴定

3.3.4 重组腺病毒Ad-Nanog在293A细胞中包装及扩增

3.3.5 病毒滴度测定

3.4 讨论

第四章 Nanog基因修饰人脐带间质干细胞

4.1 实验材料

4.2 主要仪器

4.3 主要试剂

4.3.1 细胞培养试剂

4.3.2 RT-PCR试剂

4.3.3 Western blot试剂

4.3.4 免疫组化试剂

4.4 方法

4.4.1 hucMSCs的分离培养

4.4.2 重组腺病毒Ad-Nanog感染hucMSCs最佳MOI

4.4.3 细胞爬片制作及免疫组织检测Nanog蛋白的细胞定位

4.4.4 Western blot鉴定Nanog蛋白表达

4.4.5 平板克隆形成试验

4.4.6 成骨分化诱导

4.4.7 MTT法检测细胞增殖

4.4.8 总RNA提取及逆转录反应

4.4.9 干细胞相关基因和Nanog的检测

4.4.10致瘤性分析

4.5 结果

4.5.1 重组腺病毒Ad-Nanog转染hucMSCs最佳MOI

4.5.2 免疫组化检测Nanog在hucMSCs中表达定位

4.5.3 Western blot鉴定Nanog蛋白表达

4.5.4 克隆形成能力

4.5.5 成骨分化诱导

4.5.6 MTT法检测Nanog修饰细胞增殖

4.5.7 相关基因的表达

4.5.8 致瘤性分析

4.6 讨论

结论与展望

一 、结论

二、展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文

一、发表论文

二、参加学术会议