Akt基因修饰的人脐带间质干细胞来源exosomes对大鼠急性心肌梗死损伤修复作用及机制

摘要

目的:本实验室前期研究发现人脐带间质干细胞(human umbilical cordmesenchymal stem cells，hucMSC)来源的exosomes(hucMSC-exosomes)在SD大鼠急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)模型中起着修复作用，本研究在前期研究基础上用Akt基因修饰hucMSC，分离纯化过表达Akt人脐带间质干细胞来源的exosomes(Akt-hucMSC-exosomes)，研究Akt-hucMSC-exosomes对大鼠AMI损伤修复作用及机制，为干细胞成分治疗AMI提供更有效的方法。
　　方法:采用脐带组织块贴壁培养法培养hucMSC;利用过表达Akt的腺病毒转染hucMSC，用无血清培养液培养48h收集上清;利用超滤及密度梯度离心法从上清中分离纯化exosomes，通过nanosigh分析鉴定exosomes。Western blot检测Akt-hucMSC-exosomes和hucMSC-exosomes中Akt的表达差异。体内构建大鼠急性心肌梗死模型，梗死后立即通过尾静脉注射不同来源的exosomes(Akt-hucMSC-exosomes,hucMSC-exosomes,GFP-hucMSC-exosomes)，以400μg/g的浓度注射，超声心动图分析梗死治疗后5周大鼠心功能指标的变化。体外培养心肌细胞H9C2(2-1)和内皮细胞EA.hy926，用不同来源的exosomes以100mg/ml的浓度与细胞共培养48h，观察Akt-hucMSC-exosomes对细胞的作用。通过分析Akt-hucMSC-exosomes，hucMSC-exosomes中蛋白差异，筛选出关键的蛋白。siRNA抑制关键蛋白的表达，观察低表达关键蛋白的exosomes对心肌细胞和内皮细胞的作用。
　　结果:成功分离出过表达Akt的Akt-hucMSC-exosomes，体内作用于大鼠急性心肌梗死模型能明显保护其心功能，提高心肌射血能力，并较hucMSC-exosomes作用强;体内外作用于缺氧的心肌细胞，能明显抑制心肌细胞凋亡，保护心肌细胞。体外作用于内皮细胞可以促进内皮细胞增殖、迁移，促进血管形成。Westernblot分析Akt-hucMSC-exosomes和hucMSC-exosomes蛋白组成差异，其中PDGF-D在Akt-hucMSC-exosomes中表达增高，抑制Akt-hucMSC-exosomes中PDGF-D后其Akt-hucMSC-exosomes对心肌的保护作用和对血管形成作用明显减弱。
　　结论:Akt-hucMSC-exosomes较hucMSC-exosomes具有更强的AMI损伤修复作用，并主要通过高表达PDGF-D促进血管形成在急性心肌梗死中起着保护作用，为hucMSC-exosomes临床治疗心肌梗死提供了更好的治疗方案。

目录

声明

摘要

英文缩略词中英文注释表

第一章 绪论

1．1 急性心肌梗死治疗现状

1．2 MSC治疗急性心肌梗死

1．2．1 MSC的生物学特性

1．2．2 MSC治疗心肌梗死的现状

1．3 exosomes的研究进展

1．3．1 exosomes的生物学特性

1．3．2 exosomes在组织损伤修复中的作用

1．4 Akt修饰的MSC在急性心肌梗死中的作用

第二章 研究目的、方法、实验设计方案和意义

2．1 研究目的

2．2 研究方法

2．3 实验设计方案

2．4 研究意义

第三章 Akt修饰hucMSC来源exosomes的分离及鉴定

3．1 材料与仪器

3．1．1 主要材料

3．1．2 主要仪器、耗材

3．2 方法

3．2．1 重组Akt基因腺病毒(Ad-Akt)的构建

3．2．2 Ad-Akt的包装与扩增

3．2．3 病毒滴度检测

3．2．4 Ad-Akt转染hucMSC

3．2．5 western blot检测hueMSC腺病毒转染后Akt和GFP蛋白表达

3．2．6 过表达Akt的hueMSC-exosomes(Akt-hueMSC-exosomes)的分离

3．2．7 Akt-hueMSC-exosomes的鉴定

3．2．8 Western blot分析Akt-hueMSC-exosomes蛋白成分的变化

3．3 结果

3．3．1 重组腺病毒质粒的鉴定

3．3．2 Ad-Akt包装

3．3．3 腺病毒滴度测定结果

3．3．4 Ad-Akt转染hueMSC后鉴定结果

3．3．5 Akt-hueMSC-exosomes纳米颗粒分析仪的鉴定结果

3．3．6 Akt-hucMSC-exosomes中Akt、PDGF-D表达增高

3．4 讨论

第四章 急性心肌梗死模型的构建以及Akt-hucMSC-exosomes对心肌梗死的治疗效果

4．1 材料与仪器

4．1．1 主要材料

4．1．2 主要仪器、耗材

4．2 方法

4．2．1 大鼠急性心肌梗死模型的构建

4．2．2 Akt-hueMSC-exosomes治疗心肌梗死

4．2．3 超声心动图分分析治疗效果

4．2．4 体外模拟心肌缺氧实验

4．2．5 心肌细胞摄取Akt-hucMSC-exosomes实验

4．2．6 Akt-hueMSC-exosomes对缺氧心肌细胞的作用

4．2．7 统计方法

4．3 结果

4．3．1 心肌梗死模型的建立

4．3．2 Akt-hucMSC-exosomes可以增强大鼠AMI模型的心功能

4．3．3 H9C2(2-1)摄取Akt-hucMSC-exosomes

4．3．4 Akt-hucMSC-exosomes对缺氧H9C2(2-1)有保护和抗凋亡作用

4．4 讨论

第五章 Akt-hueMSC-exosomes对血管形成的作用

5．1 材料与仪器

5．1．1 主要材料

5．1．2 主要仪器、耗材

5．2 方法

5．2．1 免疫组化分析梗死心肌组织VEGF的表达

5．2．2 Akt-hucMSC-exosomes对EA．hy926细胞增殖、迁移的作用

5．2．3 鸡胚绒毛尿囊膜实验(CAM)模拟体内Akt-hucMSC-exosomes对血管形成的作用

5．3 结果

5．3．1 大鼠心肌梗死组织VEGF的表达

5．3．2 Akt-hucMSC-exosomes促进EA-hy926增殖和迁移

5．3．3 Akt-hucMSC-exosomes促进鸡胚血管形成

5．4 讨论

第六章 Akt-hucMSC-exosomes对急性心肌梗死损伤修复的初步机制

6．1 材料与仪器

6．1．1 主要材料

6．1．2 主要仪器、耗材

6．2 方法

6．2．1 western blot检测心肌组织和H9C2(2-1)PDGFR-β的表达

6．2．2 PDGF-D siRNA干扰Akt-hueMSC来源的Akt-hucMSC-exosomes的获得

6．2．3 siRNA-Akt-hucMSC-exosomes处理缺氧心肌细胞

6．2．4 基质胶小管形成实验

6．2．5 划痕实验

6．2．6 统计方法

6．3 结果

6．3．1 Akt-hucMSC-exosomes处理后大鼠心肌组织和H9C2(2-1)PDGFR-β的表达增高

6．3．2 PDGF-D siRNA转染hucMSC后鉴定

6．3．3 干扰PDGF-D后的exosomes对心肌细胞增殖和抗凋亡作用下降

6．3．4 siRNA-Akt-hucMSC-exosomes对小管形成作用减弱

6．3．5 siRNA-Akt-hucMSC-exosomes对EA-hy926细胞迁移作用减弱

6．4 讨论

参考文献

结论与展望

一．结论

二．展望

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文及参加会议