YB1通过抑制细胞自噬性死亡而增加肿瘤细胞对三氧化二砷耐药性的研究

摘要

目的：⑴构建携带人YB1基因的腺病毒表达载体(AdYB1)和针对YB1的siRNA的腺病毒表达载体(AdsiYB1),并鉴定其生物学功能。⑵确定三氧化二砷可诱导乳腺癌细胞株MCF-7和人胃癌细胞株BGC-823发生自噬,并寻找诱发自噬的最适用药浓度。⑶用三氧化二砷诱导感染了AdYB1的MCF-7细胞和感染了AdsiYB1的BGC-823细胞发生自噬,从正反两方面证明YB1可抑制三氧化二砷诱导的肿瘤细胞自噬。⑷探索YB1抑制的三氧化二砷诱导的肿瘤细胞的自噬对细胞死亡的影响。
　　 方法：①Trizol法提取人白血病细胞K562的总RNA后,利用RT-PCR技术扩增目的片断YB1；使用T4连接酶连接BglⅡ及HindⅢ双酶切后的目的片断YB1与pAdTrack—CMV,鉴定并扩增正确重组腺病毒穿梭质粒(pAdTrackCMV-YB1)；合成能高效干扰BGC-823细胞的YB1表达的ShRNA并将其插到穿梭质粒pShuttle-H1的启动子下游,鉴定含正确目的基因的重组腺病毒穿梭质粒(pAdShuttle-H1-siYB1)克隆；分别将正确的阳性克隆穿梭质粒pAdTrack—CMV-YB1和pAdShuttle-H1-siYB1转入含有质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌进行同源重组,鉴定、扩增；应用脂质体分别将成功重组的腺病毒载体质粒pAdEasy-YB1和pAdEasy-siYB1转入293A细胞中进行包装、扩增,病毒滴度测定获得具有高感染效能的腺病毒表达载体AdYB1和AdsiYB1。将腺病毒AdYB1感染MCF-7细胞,AdsiYB1感染BGC-823细胞,经RT-PCR和Western blot方法检测干扰前后MCF-7细胞和BGC-823细胞YB1基因和蛋白的表达量的变化。②用梯度浓度的As2O3处理MCF-7细胞和BGC-823细胞,MTT法测定As2O3对MCF-7和BGC-823细胞系增殖的抑制作用；并用Western blot方法测定在梯度浓度的As2O3作用下两种细胞的自噬标记蛋白LC3-Ⅱ蛋白和p62蛋白的表达情况,以确定诱导自噬的最适用药浓度。③As2O3作用于AdYB1感染的MCF-7细胞及AdsiYB1感染的BGC-823细胞,用anti-LC3免疫荧光染色,MDC自噬特异性染料行荧光染色,Western blot检测LC3-Ⅱ蛋白和p62蛋白的表达的方法综合评价YB1对As2O3诱导的细胞自噬的影响。④用As2O3诱导感染了AdsiYB1的BGC-823细胞发生自噬前2h用3-MA(10mM)预处理细胞,Western blot方法检测LC3-Ⅱ蛋白和p62蛋白的表达以证实3-MA对自噬的抑制作用。MTT法分别检测加或不加3-MA时,不同浓度的As2O3对BGC-823的细胞毒性及AdsiYB1对它的影响,并计算各组的IC50。
　　 结果：⑴RT-PCR反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳显示扩增片断为1019bp,与目的片断大小符合。腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-YB1经BglⅡ及HindⅢ双酶切后电泳见大约9kb(质粒骨架)和1019bp(YB1基因)2个片段,与目的片断符合,测序结果表明克隆得到的序列与GenBank中YB1序列一致。同源重组腺病毒质粒pAdEasy—YB1经PacⅠ酶切后电泳,可见约4.5kb和30kb左右的电泳带各一条。重组腺病毒质粒经293A包装扩增获得高感染效率的重组腺病毒AdYB1,病毒滴度为2.5×109pfu／ml,该重组腺病毒能显著提高MCF-7细胞的YB1的mRNA及蛋白的表达水平；穿梭载体pShuttle—Hl插入序列及重组腺病毒质粒的鉴定均完全正确。经293A包装扩增获得高感染效率的重组腺病毒AdSiYB1,病毒滴度为5×109 pfu／ml。该重组腺病毒能显著抑制BGC-823细胞中YB1mRNA及蛋白的表达。⑵MTT法检测结果表明As2O3可明显抑制MCF-7细胞和BGC-823细胞的增殖活性,呈现明显的剂量效应关系。其IC50分别为4.59μ M和6.53μ M。Western blot检测可见在2μ mol／L的As2O3处理的MCF-7细胞中和4μ mol／L的As2O3处理的BGC-823细胞中,P62蛋白降解显著,LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白表达均有增加,且LC3-Ⅱ较LC3-Ⅰ增加更强且更加明显。提示As2O3能诱导MCF-7细胞和BGC-823细胞发生自噬。⑶转染了AdYB1的MCF-7细胞相对与对照组AdGFP转染的MCF-7细胞而言,由AS2O3诱导的自噬被抑制。表现为anti-LC3免疫荧光染色红色荧光强度降低及点状集聚减少。MDC染色蓝紫色荧光强度减弱及荧光颗粒减少。Western blot检测示AdYB1抑制了As2O3诱导的细胞内LC3-Ⅱ蛋白的聚集和P62的降解。相反,转染了AdsiYB1的BGC-823细胞相对与对照组Adsicontrol转染的BGC-823细胞而言,由As2O3诱导的自噬进一步增加。表现为anti-LC3免疫荧光染色红色荧光增强及点状集聚增加。MDC染色蓝紫色荧光增强及荧光颗粒增多。Western blot检测示AdsiYB1促进了As2O3诱导的细胞内LC3-Ⅱ蛋白的进一步聚集和P62的降解增多。⑷在感染AdsiYB1的BGC-823细胞中,加入预处理的3-MA后,与无义干扰组相比,原先因干扰YB1而降解的P62又重新积聚,且LC3总蛋白量及Ⅰ型向Ⅱ型的转换增加也均被抑制,证明自噬被抑制。干扰YB1可增加不同浓度的As2O3的细胞毒性。加入3-MA抑制自噬后As2O3的细胞毒性下降,说明As2O3诱导了细胞自噬性死亡,并且AdsiYB1组3-MA抑制细胞死亡的幅度大于Adsicontrol组。这种抑制效果的差异可能是因为YB1的表达的差异所导致。
　　 结论：成功构建了携带人YB1基因的腺病毒载体AdYB1并能高效感染MCF-7细胞；成功构建针对YB1的SiRNA重组腺病毒载体AdSiYB1并能有效抑制BGC-823细胞的YB1表达。为进一步研究YB1的生物学功能打下基础。2.YB1能抑制As2O3诱导的肿瘤细胞自噬性死亡,为其诱导细胞耐药提出新的机制。

目录

文摘

英文文摘

绪论

1.YB1的研究进展

1.1 YB-1的基本结构和功能

1.2 YB-1与肿瘤发生及发展

1.3 YB-1促进肿瘤细胞增殖

1.4 YB-1介导癌细胞抗凋亡的产生

1.5 YB-1与肿瘤扩散和转移的关系

1.6 YB-1诱导肿瘤细胞产生耐药能力

2.自噬作用(autophagy)

2.1 自噬作用(autophagy)的形态学特点

2.2 自噬发生过程的分子机制

2.3 自噬过程的信号通路

2.4 自噬的检测和研究方法

2.5 自噬与恶性肿瘤的关系

2.6 自噬与肿瘤细胞死亡

3.三氧化二砷

3.1 三氧化二砷的简介

3.2 三氧化二砷与自噬

第一章 YB1及YB1siRNA重组腺病毒表达载体的构建

第一节 携带YB1腺病毒载体的构建

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第二节 YB1 siRNA重组腺病毒载体的构建

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第二章 YB1调控As2O3诱导的肿瘤细胞自噬的研究

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5.小结

主要结论和展望

参考文献

缩写、致谢

攻读硕士期间发表文章