RhoC与IQGAP1在调节胃癌细胞迁移、增殖中的相互作用

摘要

研究目的:
　　 (1)检测RhoC和IQGAP1在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达,分析RhoC和IQGAP1的相关性以及两者与临床病理参数的相关性。
　　 (2)研究RhoC和IQGAP1在调控胃癌细胞迁移、增殖过程中的作用以及在调控过程中两者之间的相互关系。
　　 研究方法:
　　 (1)分别将构建的编码IQGAP1和IQGAP1-C基因的腺病毒载体以及获赠的编码结构活性型RhoC基因的腺病毒载体转染293A细胞,制备病毒,并对病毒滴定以及感染后目的蛋白的表达进行检测,选择对重组腺病毒敏感的胃癌细胞株进行后续实验。
　　 (2)采用RT-PCR、Western blotting、免疫荧光等方法,检测IQGAP1和RhoC在胃癌组织和细胞株中的表达；利用Spearman's rank相关性分析分析胃癌组织中RhoC与IQGAP1表达的相关性；利用Fisher确切概率法,分析两者的表达与临床病理参数相关性。
　　 (3)通过感染腺病毒pAd-RhoC-V14,增加细胞内结构活性型RhoC的表达,采用MTT实验分析RhoC对胃癌细胞增殖的影响；采用transwell迁移实验分析RhoC对胃癌细胞迁移的影响。
　　 (4)将质粒Flag-IQGAP1、Flag-IQGAP1-C或Flag-IQGAP1-N(分别编码IQGAP1全长、C末端或N末端)与绿色荧光蛋白(GFP)质粒共同转染胃癌细胞BGC-823,采用BrdU掺入实验分析不同结构的IQGAP1对单细胞增殖的影响。
　　 (5)通过感染编码IQGAP1(编码IQGAP1全长)或IQGAP1-C(编码IQGAP1的C末端,氨基酸:860-1657)基因的腺病毒,增加胃癌细胞内IQGAP1或IQGAP1-C的表达,采用MTT实验分析IQGAP1或IQGAP1-C在胃癌细胞增殖中的作用；采用transwell迁移实验分析IQGAP1或IQGAP1-C在胃癌细胞迁移过程中的作用。
　　 (6)通过转染RhoC-siRNA和IQGAP1-siRNA,分别干扰胃癌细胞中RhoC和IQGAP1蛋白的表达；采用MTT实验和transwell迁移实验,分别观察抑制RhoC或IQGAP1表达对胃癌细胞增殖和迁移的影响。
　　 (7)采用Western blotting对细胞粘附、迁移相关蛋白ICAM-1、vimentin、MMP-2等进行检测,进而分析RhoC和IQGAP1对上述蛋白表达的影响。
　　 (8)利用RhoC-siRNA干扰胃癌细胞内RhoC的表达,然后再将编码IQGAP1和IQGAP1-C基因的腺病毒感染胃癌细胞,通过transwell迁移实验和MTT实验分析干扰RhoC的表达是否影响IQGAP1刺激的胃癌细胞迁移和增殖；利用IQGAP1-siRNA干扰胃癌细胞内IQGAP1的表达,再将编码结构活性型RhoC基因的腺病毒感染胃癌细胞,通过transwell迁移实验和MTT实验分析干扰IQGAP1的表达是否影响RhoC刺激的胃癌细胞迁移和增殖。
　　 (9)分别将腺病毒pAd-IQGAP1或者pAd-IQGAP1-C与pAd-RhoC-V14共同感染非洲绿猴SV40转化的肾细胞COS-7和胃癌细胞BGC-823,通过免疫荧光和免疫共沉淀方法,观察RhoC与IQGAP1在细胞中的定位和结合情况。
　　 研究结果:
　　 (1)在29例胃癌组织标本中,RhoC和IQGAP1的表达高于对应癌旁组织者有22例,占总例数的75.9％(22／29)；IQGAP1和RhoC在胃癌组织中的表达水平均与肿瘤分化程度负相关,与胃癌细胞的迁移、增殖、浸润有一定的相关性,但是差异没有统计学意义。
　　 (2)利用制备的重组腺病毒pAd-IQGAP1、pAd-IQGAP1-C和pAd-RhoC-V14感染胃癌细胞；Western blotting结果显示,在感染上述腺病毒的胃癌细胞中IQGAP1、IQGAP1-C和RhoC蛋白的表达明显增加；在后续试验中,选取增殖能力较强的BGC-823细胞和迁移能力较强的AGS细胞分别做增殖和迁移分析。
　　 (3)RhoC和IQGAP1在三种胃癌细胞株中的表达明显高于胃粘膜上皮细胞株GES-1；IQGAP1在胃癌细胞内的分布以在细胞膜和细胞与细胞粘连处居多。
　　 (4)结构活性型RhoC能明显促进胃癌细胞的迁移和增殖,干扰RhoC的表达抑制了胃癌细胞迁移和增殖。
　　 (5)IQGAP1和IQGAP1-C明显增强胃癌细胞迁移和增殖能力,而IQGAP1-N对胃癌细胞增殖的影响不明显。IQGAP1-siRNA可以显著抑制细胞迁移和增殖。
　　 (6)结构活性型RhoC和IQGAP1可以明显促进胃癌细胞vimentin和MMP-2的表达,抑制ICAM-1表达。
　　 (7)干扰RhoC的表达对IQGAP1刺激的胃癌细胞迁移和增殖没有明显影响；而干扰IQGAP1的表达明显抑制了RhoC刺激的胃癌细胞迁移和增殖。
　　 (8)免疫共沉淀和免疫荧光结果显示,RhoC与IQGAP1蛋白直接结合。
　　 结论:RhoC和IQGAP1在胃癌组织中表达增加,两者的表达密切相关,并且与肿瘤的分化程度呈负相关。IQGAP1、IQGAP1-C以及结构活性型RhoC对胃癌细胞的迁移和增殖有促进作用。RhoC直接与IQGAP1的C末端结合,并将IQGAP1作为下游效应蛋白,调控胃癌的细胞迁移和增殖。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 Rho研究背景

1.1.1 Rho蛋白家族简介

1.1.2 Rho蛋白家族与肿瘤的研究进展

1.1.3 RhoC

1.2 IQGAP1研究背景

1.2.1 IQGAP蛋白家族简介

1.2.2 IQGAP1结构特点和功能

1.2.3 IQGAP1与肿瘤的研究进展

1.3 本论文研究目的、内容、意义、方法和技术路线

1.3.1 研究目的

1.3.2 研究内容

1.3.3 研究意义

1.3.4 研究方法

1.3.5 实验设计路线

第二章 腺病毒构建

2.1 材料和方法

2.1.1 材料

2.1.2 方法

2.2 结果

2.2.1 腺病毒pAd-IQGAP1-C的构建

2.2.2 腺病毒pAd-IQGAP1-Mut的构建

2.2.3 重组腺病毒的线性化和纯化

2.2.4 重组腺病毒转染293A细胞和病毒扩增

2.2.5 病毒滴度的测定

2.2.6 胃癌细胞中IQGAP1和IQGAP1-C的表达

2.3 讨论

第三章 RhoC和IQGAP1在胃癌组织和细胞株中的表达及相关性分析

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 方法

3.2 结果

3.2.1 RhoC和IQGAP1在胃癌组织中的表达

3.2.2 RhoC和IQGAP1在胃粘膜上皮细胞株和胃癌细胞株中的表达

3.3 讨论

第四章 RhoC和IQGAP1对胃癌细胞迁移和增殖的影响

4.1 材料和方法

4.1.1 材料

4.1.2 方法

4.2 结果

4.2.1 不同结构IQGAP1对胃癌细胞株BGC-823增殖的影响

4.2.2 不同结构IQGAP1对胃癌细胞株AGS迁移的影响

4.2.3 RhoC对胃癌细胞株BGC-823增殖的影响

4.2.4 RhoC对胃癌细胞株AGS迁移的影响

4.2.5 RhoC和IQGAP1对粘附迁移相关蛋白表达的影响

4.3 讨论

第五章 RhoC通过与IQGAP1相互作用促进胃癌细胞迁移和增殖

5.1 材料和方法

5.1.1 材料

5.1.2 方法

5.2 结果

5.2.1 干扰IQGAP1和RhoC的表达是否分别影响活性RhoC和IQGAP1刺激的AGS细胞迁移

5.2.2 干扰IQGAP1和RhoC的表达是否分别影响活性RhoC和IQGAP1刺激的BGC-823细胞增殖

5.2.3 Co-IP和免疫荧光方法验证RhoC与IQGAP1之间的相互作用

5.3 讨论

第六章 主要结论和展望

6.1 主要结论

6.2 展望

参考文献

致谢

攻读博士期间已发表和未发表文章