集胞藻PCC6803染色体上sll1504/sll1505-ssl2920/ssl2921-ssl2922/ssl2923毒素—抗毒素系统基因簇的研究

摘要

细菌毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin,TAsystem)由位于同一操纵子中的毒素基因和抗毒素基因组成,二者共同表达;毒素基因编码的毒素蛋白通过不同的作用机制作用于细菌重要细胞的细胞过程,诱导细胞的生长抑制或细胞死亡。抗毒素基因编码可被特殊蛋白酶降解的不稳定抗毒素蛋白;抗毒素蛋白与毒素蛋白相互作用形成毒素-抗毒素复合体,抑制毒素的细胞毒性;抗毒素或毒素-抗毒素复合体通过抗毒素与启动子调控序列结合反馈调控TA系统表达。现有的研究结果显示,细菌染色体上的一些TA系统作为胁迫反应因子参与细胞适应性胁迫反应,使细菌适应多变的环境。TA系统在介导细胞适应性胁迫反应中,通过蛋白酶对抗毒素的降解以及抗毒素对TA系统表达的的反馈调控调控TA系统的活性。具有遗传操作系统的模式蓝藻集胞藻PCC6803染色体上也存在大量的TA系统。其中染色体上的基因对sll1504/sll1505、ssl2920/ssl2921和ssl2922/ssl2923构成TA系统簇,但它们的生理功能及其活性调控机制尚不清楚。本研究拟对集胞藻PCC6803染色体上的sll1504/sil1505、ssl2920/ssl2921和ssl2922/ssl2923TA系统簇生理生化功能及其活性调控进行研究,尝试阐明这些TA系统在蓝藻细胞胁迫反应中的作用。主要内容包括:
　　 1)通过基因敲除技术构建sll1504/sll1505、ssl2920/ssl2921和ssl2922/ssl2923分别缺失和同时缺失的突变株,并分析在不同胁迫条件下的缺失突变株表型,确定这些TA系统在集胞藻适应性胁迫反应中的作用;构建受铜离子诱导的启动子PpetE控制sll1505或ssl2923表达以及sll1504/sll1505或ssl2922/ssl2923共表达的调控突变株,分析不同诱导表达调控突变株在铜离子诱导条件下细胞的生长特征,确定这些TA系统编码产物在集胞藻细胞中的生化功能。
　　 2)利用大肠杆菌选择性表达调控系统,在大肠杆菌中异源诱导表达蛋白酶Lons或ClpP2s/ClpXs以及Sll1504/Sll1505或Ssl2922/Ssl2923,通过细胞的生长和蛋白质免疫印迹(Westernblot)分析技术,研究sll1504/sll1505、ssl2920/ssl2921,ssl2922/ssl2923TA系统在蛋白水平上的活性调控。
　　 3)以lacZ为报告基因,构建sll1504/sll1505、ssl2920/ssl2921、ssl2922/ssl2923TA系统与/lacZ融合转录的调控菌株,研究这些TA系统的转录调控。
　　 根据上述研究得到以下结论:
　　 (1)sll1504/sll1505-ssl2920/ssl2921-ssl2922/ssl2923TA系统基因簇与集胞藻细胞适应温度胁迫——尤其是低温胁迫有关;sll1504/sll1505、ssl2922/ssl2923与环境胁迫因素导致的蛋白质合成抑制所致的细胞死亡或生长抑制有关,sll1504/sll1505和ssl2922/ssl2923TA系统中毒素或毒素.抗毒素的表达均可抑制集胞藻细胞生长。
　　 (2)集胞藻PCC6803中的蛋白酶Lons和ClpP2s/ClpXs不能降解Sll1504和Ssl2922抗毒素蛋白,推测集胞藻PCC6803中还存在能够降解Sll1504和Ssl2922的蛋白酶。
　　 (3)在大肠杆菌中对sll1504/sll1505、ssl2920/ssl2921,ssl2922/ssl2923的表达调控分析表明,它们的表达产物对其转录具有不同程度的激活或抑制作用,即它们在转录水平上均可实现自我调控,且它们之间存在明显的交互作用。