热纤梭菌腈水解酶表达鉴定及在枯草芽孢杆菌孢子表面的展示

摘要

腈水解酶是一种重要的工业酶，在生物化工中常被用来合成一些重要的羧酸，相对于传统的方法具有高效、反应条件温和、绿色无污染的优点。本研究首次对热纤梭菌的腈水解酶进行了研究。
　　通过生物信息学方法对热纤梭菌腈水解酶进行了研究，分析了腈水解酶的一级结构和二级结构，发现其含有很多保守序列，在保守序列上包含极有可能是组成酶的活性位点的半胱氨酸和谷氨酸残基。并对其三级结构进行了预测。
　　以热纤梭菌基因组为模板，在特异引物的作用的下，以PCR的方法扩增获得腈水解酶基因，把其与大肠杆菌表达质粒pET-28a连接起来，构建成重组质粒pET-28a-nit，该质粒转入大肠杆菌BL21，构建成重组菌BL21（pET-28a-nit），IPTG诱导重组菌表达重组腈水解酶，通过Ni-NTA对重组腈水解酶进行亲和层析纯化，以重组腈水解酶催化3-氰基吡啶生成烟酸的能力来判断酶活性的高低，其在45℃、pH7.4时具有最大催化活力，酶活达到8.15 units/mg蛋白。
　　酶固定化是提高酶稳定性及经济性一种常用技术。本研究运用枯草芽孢杆菌孢子表面展示系统，把腈水解酶展示在孢子表面进行固定化。策略为，使腈水解酶与枯草芽孢杆菌孢子外衣壳蛋白CotG融合表达。首先，构建用于孢子表面展示的重组质粒pHS-cotG-nit，具体方法为，去除大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pLJ上的乳糖诱导调控序列Pglv-inframe，构建成质粒pHS，把具有完整表达调控序列的孢子外衣壳蛋白基因cotG连接到pHS的多克隆位点，构建成重组质粒pHS-cotG，再把腈水解酶基因(nit)连接到cotG下游的多克隆位点，构建成重组质粒pHS-cotG-nit，为了使融合表达到CotG下游的腈水解酶更易于折叠成正确的构象，在cotG和nit之间加入一段可以翻译生成由六个氨基酸残基(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)组成的接头蛋白的核苷酸序列。
　　把重组质粒转化入具有四个蛋白酶缺陷的枯草芽孢杆菌DB403受体菌获得重组菌DB403（pHS-cotG-nit），DSM溶液培养重组菌36小时诱导重组菌产生芽孢，腈水解酶随着孢子外衣壳蛋白CotG表达而共表达，形成融合蛋白CotG-NIT。
　　通过SDS-PAGE和western blotting对重组孢子蛋白进行分析，发现在55KDa处有特异性条带生成，预测的融合蛋白CotG-NIT的大小为53.2KDa，其大小一致，证明腈水解酶成功展示在了孢子表面。以重组孢子催化3-氰基吡啶生成烟酸的能力来判断酶活性的高低，其也是在45℃、pH7.4时具有最大催化活力，酶活达到6.59 units/mg蛋白。相对于游离状态的酶，固定在孢子表面的腈水解酶虽然催化3-氰基吡啶的能力略有降低，但是其对极端环境的耐受能力更强，在较高温度下或较极端的环境下仍然保持很高的活性，而且反应结束后通过简单的离心可以回收重组孢子，再以回收的孢子催化3-氰基吡啶，重复利用四次后孢子仍然具有75.3％的腈水解酶活性。这一研究通过芽孢表面展示技术创立了一种有效的腈水解酶固定化方法，在生物化工酶促催化领域很有意义。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 腈水解酶

1．1．1 腈类物质的简介

1．1．2 腈水解酶的来源

1．1．3 具有腈水解酶活性的菌株的筛选方法

1．1．4 腈水解酶的结构

1．1．5 腈水解酶的催化机理

1．1．6 腈水解酶的分类

1．1．7 腈水解酶的应用

1．2 枯草芽孢杆菌孢子表面展示系统

1．2．1 枯草芽孢杆菌孢子表面展示的优点

1．2．2 枯草芽孢杆菌孢子的结构

1．2．3 枯草芽孢杆菌孢子表面展示的原理

1．2．4 枯草芽孢杆菌孢子表面展示所用载体蛋白

1．2．5 枯草芽孢杆菌孢子表面展示系统的主要应用

1．3 本研究的意义

1．4 本研究的主要内容和技术路线

1．4．1 本研究的主要内容

1．4．2 本研究的主要技术路线

第二章：热纤梭菌腈水解酶生物信息学分析

2．1 所用生物信息学分析方法

2．2 生物信息学分析结果

2．2．1 蛋白质一级结构分析

2．2．2 蛋白质二级结构分析

2．2．3 蛋白质三级结构分析

2．2．4 腈水解酶基序与进化分析

2．3 本章小结

第三章 热纤梭菌腈水解酶基因在大肠杆菌中的表达及多克隆抗体的制备

3．1 材料和试剂

3．1．1 菌种和质粒

3．1．2 工具酶和试剂盒

3．1．3 培养基、缓冲液、试剂

3．1．4 主要实验仪器

3．2 方法步骤

3．2．1 热纤梭菌基因组的提取(上海生工UNIQ-10柱式细菌基因组抽提试剂盒)

3．2．2 腈水解酶基因的获得

3．2．3 原核表达质粒pET-28a-nit的构建

3．2．4 目标蛋白的原核表达及亲和层析纯化

3．2．5 Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白

3．2．6 超滤管去除纯化蛋白中的离子，并对纯化后的蛋白进行浓缩

3．2．7 多克隆抗体的制备及纯化

3．2．8 western blotting操作步骤

3．2．9 多克隆抗体效价的测定

3．3 结果与分析

3．3．1 原核表达重组质粒pET-28a-nit的构建

3．3．2 SDS-PAGE分析

3．3．3 多克隆抗体效价的测定

3．4 本章小结

第四章 在枯草芽孢杆菌孢子表面展示热纤梭菌腈水解酶NIT

4．1 材料和试剂

4．1．1 菌种和质粒

4．1．2 工具酶和试剂盒

4．1．3 培养基、缓冲液、试剂

4．1．4 主要实验仪器

4．2 方法和步骤

4．2．1 pHS质粒的构建

4．2．2 pHS-cotG质粒的构建

4．2．3 pHS-cotG-nit质粒的构建

4．2．4 枯草芽孢杆菌感受态的制备

4．2．5 重组枯草芽孢杆菌DB403(pHS-cotG-nit)的构建

4．2．6 诱导形成重组芽孢

4．2．7 孢子表面展示腈水解酶的鉴定

4．3 结果分析

4．3．1 重组质粒pns-cotG-nit的鉴定

4．3．2 重组孢子的鉴定

4．5 本章小结

第五章 重组腈水解酶的活性分析

5．1 实验材料

5．1．1 实验试剂及药品

5．1．2 缓冲液

5．1．3 主要实验仪器

5．2 方法步骤

5．2．1 蛋白浓度的测定(Bradford法)

5．2．2 孢子悬液的制备

5．2．3 酶活的测定方法

5．2．4 高效液相色谱(HPLC)检验条件

5．2．5 大肠杆菌表达的重组腈水解酶活力测定

5．2．6 重组孢子活力的测定

5．2．7 蛋白酶对重组孢子催化活力的影响

5．2．8 重组孢子回收再利用

5．3 结果与分析

5．3．1 不同温度下的酶活力

5．3．2 不同pH条件下的酶活力

5．3．3 蛋白酶处理后重组孢子催化活力的变化

5．3．4 重组孢子回收再利用

5．4 本章小结

第六章 总结与展望

6．1 主要工作总结

6．2 展望

参考文献

致谢

在学期间发表的学术论文及申请专利

参与的主要课题