人胚胎干细胞饲养层的制备以及定向诱导分化为神经元样细胞的初步研究

摘要

目的：
　　制备一种简便实用的人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)饲养层，并研究白藜芦醇体外诱导hESCs向神经元样细胞的分化。
　　方法:
　　1、小鼠胚胎肝基质细胞系(KM3)经过10μg/mL丝裂霉素-C处理，分别在-70℃和液氮中冻存15d、30d和60d后复苏。
　　2、通过形态学、细胞增殖能力、细胞因子表达等实验来观察复苏后的KM3生物学活性，应用形态学、增殖率实验、碱性磷酸酶染色等方法评价hESCs未分化特性和增殖潜能。
　　3、hESCs常规消化后，经拟胚体悬浮培养4d，然后在添加了5μM自藜芦醇的神经诱导液贴壁培养12d。
　　4、通过倒置显微镜连续观察细胞形态，免疫荧光染色观察各个阶段特异性标志Nestin和NF-M的表达，实时定量PCR(RT-qPCR)和Western Blot检测神经细胞阶段NF-M基因和蛋白的相对表达量。
　　结果:
　　1、10μg/mL丝裂霉素-C处理的KM3液氮冻存60 d，KM3形态变化不明显，呈长梭形，存活率为(84.60±1.14)％，-70℃冻存60 d，存活率为(66.40士2.88)％，细胞容易脱落，维持时间短，bFGF表达量明显降低;液氮冻存60 dKM3饲养层上的人胚胎干细胞，呈典型的人胚胎干细胞鸟巢状结构，边缘界限清晰，分化率为(16.33±2.08)％，-70℃冻存60 d的KM3饲养层上的人胚胎干细胞分化率为(37.67±3.51)％。
　　2、与对照组比较，5μM白藜芦醇诱导后，神经元样细胞以贴壁团块为中心成放射状蜘蛛网样交织生长，细胞胞体饱满，立体感强，细胞多为两个以上突起，杂质细胞少，免疫荧光显示NF-M阳性表达，RT-qPCR和Western Blot检测到NF-M基因和蛋白的表达，并且与对照比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:
　　1、丝裂霉素-C处理冻存复苏的KM3可直接用于人胚胎干细胞传代培养，-70℃短期或液氮冻存效果相对较好，为干细胞研究提供了经济、稳定、简便的饲养层细胞。
　　2、白藜芦醇可以提高人胚胎干细胞在体外定向诱导为神经元样细胞的诱导效率，并且诱导得到的细胞纯度高，为组织工程的应用提供了潜在依据。

目录

声明

摘要

主要英文缩略词索引

第一章 绪论

1．1 胚胎干细胞

1．2 人胚胎干细胞

1．2．1 人胚胎干细胞特性及鉴定

1．2．2 人胚胎干细胞饲养层培养体系

1．3 人胚胎干细胞定向诱导分化

1．3．1 hESCs定向诱导为神经元概述

1．3．2 hESCs定向诱导神经细胞的方法

1．3．3 hESCs定向神经诱导的过程

1．3．4 神经特异性标志物

1．4 白藜芦醇特性

1．4．1 白藜芦醇生物学特性

1．4．2 白藜芦醇神经保护作用

1．5 hESCs的应用

1．6 研究目的内容、方法和意义

1．6．1 研究目的

1．6．2 研究内容

1．6．3 研究方法

1．6．4 研究意义

第二章 人胚胎干细胞饲养层的制备

2．1 材料

2．1．1 人胚胎干细胞及饲养层细胞

2．1．2 主要仪器、耗材

2．1．3 试剂及配制

2．2 方法

2．2．1 丝裂霉素-C处理后细胞冻存与复苏

2．2．2 苏木素-伊红染色(hematoxylin and eosin staining，HE)和扫描电镜观察

2．2．3 生长曲线

2．2．4 Western Blot检测bFGF蛋白

2．2．5 hESCs传代

2．2．6 统计分析

2．3 结果

2．3．1 KM3存活率

2．3．2 KM3形态

2．3．3 生长曲线

2．3．4 bFGF蛋白表达水平

2．3．5 hESCs传代培养

2．4 讨论

第三章 人胚胎干细胞定向诱导分为神经元样细胞

3．1 材料

3．1．1 人胚胎干细胞

3．1．2 主要仪器、耗材

3．1．3 主要试剂及配制

3．2 方法

3．2．1 人胚胎干细胞培养

3．2．2 EB培养

3．2．3 诱导分化

3．2．4 免疫荧光染色

3．2．5 荧光定量PCR

3．2．6 Western Blot

3．2．7 统计学分析

3．3 结果

3．3．1 hESCs神经诱导不同阶段细胞形态

3．3．2 细胞免疫荧光染色

3．3．3 荧光定量PCR分析NF-M基因的表达

3．3．4 Western Blot定量检测NF-M蛋白的表达

3．4 讨论

结论与展望

结论

展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文