集胞藻PCC6803染色体上的mnt/hepnl-relBE4-vapBCl TA系统簇研究

摘要

毒素-抗毒素系统(Toxin-antitoxin，TA system)由位于同一操纵子中分别编码毒素蛋白和抗毒素蛋白的毒素基因和抗毒素基因构成。其编码的毒素蛋白具有不同的生化活性，可通过影响翻译、复制、细胞壁的生物合成等过程调控细胞的生长;抗毒素由N-末端的DNA结合结构域和C-末端的毒素结合结构域构成，可被依赖ATP的蛋白酶降解。在正常条件下，抗毒素通过毒素结合结构域与毒素相互作用形成复合体，拮抗毒素的细胞毒性;并通过N-末端的DNA结合结构域介导抗毒素或毒素-抗毒素蛋白复合体与启动子区域DNA序列结合，反馈调控操纵子的表达。在胁迫条件下，细胞中激活的蛋白酶降解抗毒素，因此TA系统转录上调，被释放的毒素作用于相应的细胞过程抑制细胞生长。已证明一些TA系统作为胁迫反应因子，通过调控细菌生长使细胞适应不同的环境胁迫。具有独特环境适应能力的蓝细菌集胞藻PCC6803染色体上存在大量的TA系统，包括已鉴定的mnt/hepn，relBE，vapBC等TA系统家族，但这些TA系统的生理功能尚不清楚。本文对PCC6803染色体上的mnt/hepn，relBE，vapBC家族中的mnt/hepn1，relBE4，vapBC1 TA系统的生理及遗传特征进行了研究，主要内容包括:
　　(1)构建并分析mnt/hepn1，relBE4，vapBC1 TA系统缺失突变株、TA系统双缺失突变株和TA系统同时缺失突变株在CdSO4、H2O2、正己烷胁迫条件下和无机碳饥饿等胁迫条件下的生长表型，确定这些TA系统在集胞藻细胞适应特定的环境胁迫反应过程中的作用;
　　(2)以lacZ为报告基因，构建mnt/hepn1，relBE4，vapBC1 TA系统与lacZ融合转录的调控菌株/藻株，研究mnt/hepn1，relBE4，vapBC1 TA系统分别在大肠杆菌和集胞藻细胞中的反馈调控、在胁迫条件下的表达调控以及表达产物在细胞适应环境胁迫中的作用;
　　(3)构建受铜离子诱导调控的启动子PpetE控制vapBC1组分过表达的集胞藻调控突变株，分析在诱导毒素或毒素-抗毒素过表达时对蓝藻细胞生长的影响以及对蓝藻细胞适应环境胁迫的影响。
　　根据上述研究得到以下结论:
　　(1)分别属于三个不同家族的TA系统mnt/hepn1-relBE4-vapBC1与集胞藻适应氧化、碳饥饿胁迫无关，mnt/hepn1系统可能与集胞藻适应有机溶剂有关;但vap BC1系统与蓝藻细胞适应镉胁迫有关，其编码的抗毒素VapB1具有关键的作用。
　　(2) mnt/hepn1，relBE4和vapBC1 TA系统的反馈调控模式不同于典型的TA系统，并且各自在异源宿主大肠杆菌和自源宿主集胞藻细胞中的反馈调控模式也不同;尽管vapBC1系统与集胞藻细胞适应镉胁迫有关，但该系统的转录并不受镉胁迫诱导调控。
　　(3)在正常生长条件下，可能由于过表达的毒素VapC1被尚待证明的与VapB1功能重叠的抗毒素所中和，毒素VapC1过表达并不导致集胞藻细胞生长抑制;在镉胁迫条件下，抗毒素VapB1的过表达可提高集胞藻细胞适应镉胁迫的能力，进一步表明抗毒素VapB1在细胞适应镉胁迫中的关键作用。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 细菌毒素-抗毒素系统

1．1．1 细菌TA系统的分类

1．1．2 毒素-抗毒素系统的生理功能

1．2 细菌TA系统

1．2．1 mnt／hepn毒素-抗毒素系统

1．2．2 relBE毒素-抗毒素系统

1．2．3 vapBC毒素-抗毒素系统

1．2．4 MazEF毒素-抗毒素系统

1．3 蓝藻及其染色体上的TA系统

1．3．1 蓝藻

1．3．2 集胞藻PCC 6803染色体上的毒素-抗毒素系统

1．4 本研究的目的

第二章 mnt／hepn1-relBE4-vapBC1 TA系统簇生理功能研究

2．1 材料和实验方法

2．1．1 分子生物学操作方法

2．1．2 菌株及其培养方法

2．1．3 集胞藻细胞染色体的提取

2．1．4 集胞藻细胞的转化和转化子的筛选

2．1．5 集胞藻藻株胁迫诱导

2．2 结果

2．2．1 mnt／hepn1、relBE4和vapBC1系统单缺失突变株在H2O2胁迫条件下的生长表型

2．2．2 单缺失突变株在无机碳饥饿条件下的生长表型

2．2．3 单缺失突变株在正己烷胁迫条件下的生长表型

2．2．4 单缺失突变株在镉胁迫条件下的生长表型

2．2．5 mnt／hepn1、relBE4和vapBC1系统双缺失突变重组质粒构建

2．2．6 mnt／hepn1-relBE4-vapBC1双缺失突变株的构建

2．2．7 mnt／hepn1-relBE4-vapBC1 TA系统双缺失突变株和三缺失突变株在镉胁迫条件下的生长特征

2．3 讨论

第三章 TA系统簇mnt／hepn1-relBE4-vapBC1在转录水平上的调控作用

3．1 材料和方法

3．1．1 菌株、培养条件和分子生物学操作

3．1．2 LacZ活性的测定

3．1．2 数据分析

3．2 结果

3．2．1 mnt／hepn1-relBE4-vapBC1TA系统表达调控质粒的构建

3．2．2 mnt／hepn1-relBE4-vapBC1系统在大肠杆菌中的反馈调控

3．2．3 mnt／hepn1-relBE4-vapBC1系统在集胞藻细胞中的反馈调控

3．2．4 mnt／hepn1-relBE4-vapBC1转录调控突变株在镉胁迫条件下的生长表型

3．2．5 镉诱导条件下mnt／hepn1-relBE4-vapBC1TA系统的转录调控

3．3 讨论

第四章 mnt／hepn1-relBE4-vapBC1 TA系统组分过表达对蓝藻适应Cd胁迫的影响

4．1 材料和方法

4．2 结果

4．2．1 受铜离子诱导表达整合性重组质粒的构建

4．2．2 构建铜离子诱导毒素或抗毒素组分共表达的表达调控突变株

4．2．3 vapBC1系统组分过表达突变株在正常条件下的生长表型

4．2．4 镉胁迫条件下过表达调控突变株的生长特征

4．3 讨论

第五章 总结和展望

5．1 主要结论

5．2 研究展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文

附录Ⅰ 缩略语表

附录Ⅱ 主要实验仪器

附录Ⅲ 主要试剂及配制

附录Ⅳ 主要试剂