莲房原花青素对极低频电磁场致脑氧化损伤学习记忆的预防及机制研究

摘要

极低频电磁场(extremely low frequency electromagnetic field，简称ELF-EMF)主要由各种家用电器产生，它的频谱在300Hz以内，是以非热效应为主的辐射。近年来大量研究指出，ELF-EMF对神经系统、心血管系统、免疫系统和生殖系统等均产生不良影响，尤其中枢神经系统对ELF-EMF极为敏感。但目前对ELF-EMF的研究仍集中在对健康风险的评估阶段，缺少评估后防护措施的研究报道。基于此，本论文以莲房原花青素(lotus seedpod procyanidins，LSPCs)为实验材料，以雄性ICR小鼠为动物模型，研究ELF-EMF对脑氧化损伤学习记忆的影响及LSPCs的预防作用和预防途径。旨在为ELF-EMF辐照的膳食防护提供实验基础和理论参考，主要研究内容如下:
　　1.LSPCs对ELF-EMF致脑氧化应激损伤学习记忆的预防作用
　　(1)ELF-EMF致脑氧化应激损伤学习记忆模型的建立
　　以雄性ICR小鼠为模型动物，在50Hz、不同场强(2、4、6、8、10mT)下连续辐照不同天数，4h/d。每7d，通过Morris水迷宫实验和测定组织中SOD活性和MDA含量，考查ELF-EMF致小鼠损伤程度。结果，在实验辐照场强范围内(2-10mT)，随着辐照时间的延长小鼠逃避潜伏期不断增加。当辐照28d后，8mT和10mT组小鼠的逃避潜伏期显著增加(p＜0.01），在目标象限停留时间显著减少(p＜0.01)，海马和血清中SOD活力下降(p＜0.01)、MDA含量上升(p＜0.01)。故ELF-EMF致脑氧化应激损伤学习记忆模型的最佳条件为:50Hz、8mT下连续辐照28d,4h/d。
　　(2)LSPCs对ELF-EMF致脑氧化应激损伤学习记忆的预防作用
　　实验分为正常组、ELF-EMF组和LSPCs预防组(30、60和90mg/kg·bw·day)，其中LSPCs预防组从辐照前15天开始灌胃给药直至实验结束。辐照条件为:50Hz、8mT下连续辐照28d，4h/d。结果，当辐照21d时，三个LSPCs组中小鼠海马和血清中SOD、CAT和GPx的活性增强，MDA、NO和ROS含量以及NOS活性呈现下降趋势，且均存在剂量-效应关系，其中90mg/kg·bw LSPCs组血清及海马中各项指标均达到极显著水平（p＜0.01，均与ELF-EMF组相比）。给予LSPCs组小鼠的逃避潜伏期和游泳距离显著性下降（p＜0.01，均与ELF-EMF组相比），而且游泳轨迹趋于正常化。病理结果显示，LSPCs灌胃组小鼠的海马CA1和CA3区锥体细胞数显著增多(p＜0.05，与ELF-EMF组相比)，同时锥体细胞规则分布，细胞完整。以上均以90mg/kg·bw LSPCs组效果最佳。综上研究表明，LSPCs对ELF-EMF致脑氧化应激损伤学习记忆具有显著的预防作用。
　　2.LSPCs对ELF-EMF致脑氧化应激损伤学习记忆信号通路的调节作用
　　动物分组和给予受试物剂量同上，在选定的辐照损伤条件下实验结束后，利用HPLC检测小鼠海马组织中兴奋性递质谷氨酸含量;采用Fluo-3/AM荧光标记测定细胞内游离Ca2+浓度;利用Western Blotting检测ELF-EMF氧化应激损伤损伤学习记忆有关的MAPK及其下游信号通路上关键调控蛋白的表达。结果小鼠长时间暴露在ELF-EMF下海马组织中谷氨酸含量异常增多，突触后膜谷氨酸受体NMDA的NR2B亚基蛋白表达显著上升，细胞内游离Ca2+浓度显著增加，ROS含量也随之增加（p＜0.05，以上均与正常组相比）。长时间ELF-EMF辐照后海马组织中p-CREB，p-ERK1和p-ERK2磷酸化表达量显著下降，ASK1、磷酸化p-JNK1和p-JNK2表达显著上升（p＜0.05，以上均与正常组相比）。
　　经LSPCs预处理后，由ELF-EMF导致氧化应激损伤学习记忆信号途径的关键因素得到显著性改善，在实验浓度范围内存在剂量-效应关系，且以90mg/kg·bwLSPCs组效果最佳，并趋于正常组。以上结果表明，LSPCs能通过降低海马组织中谷氨酸含量，减少神经细胞持续兴奋性，降低突触后膜受体NMDA表达，关闭该离子通道，从而减少Ca2+内流和ROS的产生，进而来调控MAPK及下游信号通路蛋白的异常表达。从行为学上，表现出小鼠学习记忆能力得到显著改善。

目录

声明

摘要

缩写词表

第一章 绪论

1．1 极低频电磁场的生物学效应

1．1．1 极低频电磁场简述

1．1．2 极低频电磁场对中枢神经系统的影响

1．1．3 极低频电磁场对学习记忆行为的影响

1．2 原花青素的研究概况

1．2．1 原花青素的结构和分布

1．2．2 原花青素的生物活性

1．3 本课题的研究目的和主要内容

1．3．1 本课题研究目的

1．3．2 主要研究内容

第二章 极低频电磁场致脑氧化应激损伤学习记忆动物模型的建立

引言

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 实验动物分组

2．2．2 辐射装置和方法

2．2．3 Morris水迷宫测试

2．2．4 组织样品收集

2．2．5 海马组织匀浆制备

2．2．6 超氧化物歧化酶(Super oxide dismutase，SOD)测定

2．2．7 血清和海马中的丙二醛(MDA)含量测定

2．2．8 总蛋白浓度测定

2．2．9 数据统计

2．3 结果与分析

2．3．1 ELF-EMF对小鼠水迷宫训练的影响

2．3．2 ELF-EMF对小鼠血清中SOD活力和MDA含量的影响

2．3．3 ELF-EMF对小鼠海马组织中SOD活力和MDA含量的影响

2．4 讨论

第三章 LSPCs对极低频电磁场致脑氧化应激损伤学习记忆的预防作用

引言

3．1 实验材料

3．1．1 实验动物

3．1．2 实验试剂

3．1．3 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 主要试剂配制

3．2．2 实验动物药物处理

3．2．3 辐射装置

3．2．4 Morris水迷宫测试

3．2．5 组织样品收集

3．2．6 海马组织HE染色分析

3．2．7 血清及海马组织中氧化损伤指标分析

3．2．8 总蛋白浓度测定

3．2．9 数据统计

3．3 结果与分析

3．3．1 LSPCs对小鼠体重的影响

3．3．2 LSPCs对ELF-EMF致学习记忆损伤小鼠水迷宫训练的影响

3．3．3 LSPCs对小鼠海马组织的氧化应激影响

3．3．4 LSPCs对小鼠脏器指数的影响

3．3．5 LSPCs对小鼠的脂质过氧化产物和抗氧化酶的影响

3．3．6 LSPCs对小鼠海马组织和血清中NO和NOS的影响

3．3．7 海马组织病理学分析

3．4 讨论

第四章 LSPCs对ELF-EMF致脑氧化应激损伤学习记忆信号通路的调节作用

引言

4．1 实验材料

4．1．1 实验动物

4．1．2 实验试剂

4．1．3 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 主要试剂配制

4．2．2 实验动物给药处理

4．2．3 辐射装置

4．2．4 海马组织中谷氨酸含量测定

4．2．5 Western-bloting测定海马组织中ASK1、NR2B、CREB和MAPKs含量蛋白样品制备

4．2．6 海马组织中Ca2+含量测定

4．2．7 数据统计

4．3 结果与分析

4．3．1 测定谷氨酸方法的可靠性

4．3．2 LSPCs对小鼠海马谷氨酸含量的影响

4．3．3 LSPCs对小鼠海马细胞内Ca2+浓度的影响

4．3．4 LSPCs对小鼠海马中NR2B受体含量的影响

4．3．5 LSPCs对ELF-EMF引起小鼠海马中MAPK信号通路改变的影响

4．3．6 LSPCs对ELF-EMF引起小鼠海马中CREB磷酸化改变的影响

4．4 讨论

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

致谢

硕士期间发表的论文