Toll样受体4在成骨细胞共培养体系中对干细胞向破骨细胞分化的影响及机制

摘要

目的：
　　探索Toll样受体4(Toll Like Receptor，TLR)-4在“干细胞（上室）-成骨细胞（下室）”共培养体系中对大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrowmensenchymal stem cells，BMSCs)向破骨细胞分化的影响及机制。
　　方法：
　　以Percoll密度梯度离心法分离大鼠BMSCs，常规培养、传代，镜下观察细胞形态。取第3代活力良好的细胞以流式细胞技术检测经典干细胞表面标志物CD34、CD44、CD54、CD90，鉴定干细胞。取孔径为8μm的Transwell小室，将第3代活力良好的BMSCs制成细胞悬液（密度为1×107/ml）置于共培养小室的上室;将由大鼠BMSCs诱导分化而来的大鼠成骨细胞株进行培养、传代并鉴定后，取活力较好的第3代细胞制成细胞悬液（密度为1×107/ml）置于共培养小室的下室，构建“干细胞-成骨细胞”共培养体系。将构建完成的“干细胞-成骨细胞”共培养体系分为TLR-4激活组和空白组，前者上室中加入TLR-4激动剂脂多糖(10ng/ml)，后者上室中加入等体积PBS缓冲液，两组的上室中均加入破骨细胞诱导培养基进行培养。培养第6天，分别取TLR-4激活组和空白组上室细胞制成细胞爬片，进行抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acidphosphatase，TRAP)染色，染色阳性认为是破骨细胞，比较两组上室破骨细胞数目。在培养第6天，分别取2组下室细胞悬液，以β-肌动蛋白作为内参，蛋白质印迹法（Western blot法）检测并比较核因子κB受体活化因子配体(Receptoractivator for nuclear factor-κB ligand，RAKL)的蛋白表达。
　　结果：
　　Percoll密度梯度离心法获得细胞，镜下观察原代细胞由最初的散在的非贴壁细胞逐渐形成集落并贴壁，形态由小圆形淋巴细胞样转变为纤维细胞样。经流式细胞技术鉴定，细胞表面标志物表达为CD34阴性，CD44阳性，CD54阳性，CD90阳性，符合BMSCs细胞表面标志物表达特征。细胞在“干细胞-成骨细胞”共培养体系中经干预措施处理后，TRAP染色结果显示，TLR-4激活组上室中破骨细胞数目（55.83±2.44个）多于空白组上室细胞中破骨细胞数目（37.50±2.20个），结果差异有统计学意义（t=13.556，P＜0.05）。Western blot法检测结果显示，TLR-4激活组RANKL的蛋白表达较空白组RANKL的蛋白表达更为明显，定量分析显示差异具有统计学意义(t=17.630，P＜0.05)。
　　结论：
　　在“干细胞-成骨细胞”共培养体系中，激活TLR-4能够促进干细胞向破骨细胞分化，其机制可能与TLR-4促进成骨细胞分泌RANKL有关，上调的RANKL与干细胞表面的核因子κB受体活化因子（Receptor activator for nuclear factor-κB，RANK）作用，通过RANKI/RANK通路促进干细胞向破骨细胞分化。

目录

声明

摘要

主要略缩词一览表

引言

第一章 大鼠骨髓间质干细胞的分离、培养及鉴定

1．前言

2．实验目的

3．实验材料

3．1 实验动物

3．2 实验试剂／试剂盒

3．3 实验仪器及器材

3．4 实验试剂的配置

4．实验方法

4．1．大鼠BMSCs的分离及原代培养

4．2．流式细胞技术检测大鼠BMSCs表面标志物

4．3．MTT法检测大鼠BMSCs细胞活力

5．实验结果

5．1．大鼠BMSCs的分布及形态

5．2．流式细胞技术检测细胞生长周期和细胞表面标志物

5．3．MTT法检测细胞活力及生长曲线的绘制

6．结果讨论

第二章 TLR-4在“干细胞-成骨细胞”共培养体系中对BMSCs向破骨细胞分化的影响

1．前言

2．实验目的

3．实验材料

3．1 实验动物

3．2 实验试剂／试剂盒

3．3 实验仪器及器材

3．4 实验试剂的配置

4．实验方法

4．1．大鼠BMSCs的分离、培养、传代及流式细胞技术鉴定表面标志物

4．2．诱导大鼠BMSCs向大鼠成骨细胞分化大鼠成骨细胞株的鉴定

4．3．Western blotting检测骨钙素及Ⅰ型胶原鉴定大鼠成骨细胞株

4．4．茜素红染色及碱性磷酸酶染色鉴定大鼠成骨细胞株

4．5．“干细胞-成骨细胞”共培养体系的构建

4．6．共培养体系中诱导干细胞向破骨细胞分化及分组干预

4．7．TRAP染色检测破骨细胞及破骨细胞计数

5．实验结果

5．1．大鼠BMSCs的分离、培养、传代及流式细胞技术鉴定表面标志物

5．2．大鼠成骨细胞形态及鉴定结果

5．3．“干细胞-成骨细胞”共培养体系

5．4．TRAP染色及染色阳性细胞计数分析

6．结果分析

第三章 TLR-4在“干细胞-成骨细胞”共培养体系中促进BMSCs向破骨细胞分化的机制研究

1．前言

2．实验目的

3．实验材料

3．1 实验动物

3．2 实验试剂／试剂盒

3．3 实验仪器及器材

3．4 实验试剂的配置

4．实验方法

4．1．大鼠BMSCs的分离、培养、传代及流式细胞技术鉴定表面标志物

4．2．诱导大鼠BMSCs向大鼠成骨细胞分化大鼠成骨细胞株的鉴定

4．3．“干细胞-成骨细胞”共培养体系的构建及分组处理

4．4．Western blotting检测RANKL的表达

5．实验结果

5．1．大鼠BMSCs的分离、培养、传代及流式细胞技术鉴定表面标志物

5．2．大鼠成骨细胞的诱导生成及鉴定

5．3．TLR-4对“干细胞-成骨细胞”中RANKL表达的影响

6．结果分析

参考文献

综述：RANKL／RANK通路在破骨细胞形成过程中的作用

攻读硕士学位期间发表文章

致谢