靶向C/EBp-β基因沉默对肝癌细胞SMMC-7721增殖、凋亡、迁移的影响

摘要

研究目的:
　　构建针对C/EBP-β慢病毒质粒;转染肝癌细胞株SMMC-7721，筛选并培养稳定干扰C/EBP-β表达的SMMC-7721细胞株;进一步研究沉默C/EBP-β对肝癌细胞株SMMC-7721的细胞增殖、凋亡、迁移、细胞周期蛋白表达的影响。
　　研究方法:
　　1.利用慢病毒介导RNAi技术，设计针对C/EBP-β及eGFP（对照）shRNA序列，分别装入pLKO.1-TRC质粒，进行慢病毒包装，构建针对C/EBP-β和eGFP的慢病毒质粒，提取质粒并测序。
　　2.将已包装成功的sh-C/EBP-β和sh-eGFP慢病毒转染SMMC-7721，嘌呤霉素筛选并培养针对C/EBP-β稳定干扰的细胞株SMMC-7721-pLKO-sh-C/EBP-β及针对eGFP稳定干扰的细胞株SMMC-7721-pLKO-sh-eGFP。Western Blot分别检测两组细胞C/EBP-β的表达情况。
　　3.CCK8法检测沉默C/EBP-β基因对肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响。
　　4.Western Blot检测沉默C/EBP-β基因对肝癌SMMC-7721细胞周期蛋白Cyclin B1表达的影响。
　　5.Western Blot检测沉默C/EBP-β基因对肝癌SMMC-7721细胞抗凋亡蛋白Bcl-2及凋亡相关蛋白Bax的表达影响。
　　6.划痕实验及Transwell迁移实验检测沉默C/EBP-β基因对SMMC-7721迁移能力的影响。
　　研究结果:
　　1.本实验包装的sh-C/EBP-β和sh-eGFP慢病毒具有感染肝癌SMMC-7721细胞细胞系能力，获得了针对C/EBP-β基因的稳定干扰细胞株SMMC-7721-pLKO-sh-C/EBP-β，针对eGFP基因的稳定干扰细胞株SMMC-7721-pLKO-sh-eGFP。
　　2.Western Blot检测显示:与对照组SMMC-7721-pLKO-sh-eGFP相比，pLKO-sh-C/EBP-β慢病毒可显著抑制SMMC-7721细胞内C/EBP-β的表达（P＜0.05）。
　　3.CCK8法检测显示:与对照组SMMC-7721-pLKO-sh-eGFP相比，实验组SMMC-7721-pLKO-sh-C/EBP-β的增殖速度显著提高(相对增值率136.8％，P＜0.05)。
　　4.Western Blot检测显示:与对照组SMMC-7721-pLKO-sh-eGFP相比，实验组SMMC-7721-pLKO-sh-C/EBP-β的周期蛋白Cyclin B1表达增强(P＜0.05)。
　　5.Western Blot检测显示:与对照组SMMC-7721-pLKO-sh-eGFP相比，实验组SMMC-7721-pLKO-sh-C/EBP-β促进了抗凋亡蛋白Bcl-2表达(P＜0.05)并抑制凋亡相关蛋白Bax的表达(P＜0.05)。
　　6.划痕实验及Transwell迁移实验显示:与对照组SMMC-7721-pLKO-sh-eGFP相比，实验组SMMC-7721-pLKO-sh-C/EBP-β的迁移能力明显增强，迁移抑制率为-292.3％（P＜0.05）。
　　研究结论:
　　本实验成功构建pLKO-sh-C/EBP-β载体，并筛选出沉默C/EBP-β的稳定干扰细胞株;沉默C/EBP-β对肝癌细胞SMMC-7721的增殖、迁移有促进作用，对其凋亡有抑制作用，且其细胞周期蛋白Cyclin B1表达升高。为初步阐明C/EBP-β在肿瘤发生发展机制中的角色及寻找恶性肿瘤靶点治疗的新方向，具有较大的理论和实际意义。

目录

声明

摘要

英文缩略语表

第一章 绪论

1．1 研究背景

1．2 本研究的目的意义、内容与技术路线

1．2．1 目的意义

1．2．2 研究内容

1．2．3 技术路线图

第二章 C／EBP-β sh-RNA慢病毒干扰载体构建

2．1 材料

2．2 方法

2．2．1．细胞培养

2．2．2．细胞传代

2．2．3．细胞冻存

2．2．4．细胞复苏

2．2．5．重组慢病毒构建

2．3 统计学处理

2．4 结果

2．4．1 重组慢病毒载体的鉴定结果

2．4．2 包装慢病毒、感染目的细胞并筛选获得稳定干扰细胞株

2．4．3 Western Blot法检测C／EBP-β干扰效果

2．5 讨论

第三章 沉默C／EBP-β对肝癌细胞系SMCC-7721增殖、迁移和细胞凋亡的影响

3．1 材料

3．2 方法

3．2．1 细胞培养

3．2．2 细胞传代

3．2．3 细胞冻存

3．2．4 细胞复苏

3．2．5 CCK-8测诱导干扰序列表达后细胞增殖率

3．2．6 Western blot检测干扰序列表达后相关蛋白表达

3．2．7 划痕实验检测细胞迁移能力变化

3．2．8 Transwell迁移实验检测细胞迁移能力变化

3．3 统计学处理

3．4 结果

3．4．1 CCK8法检测细胞相对增殖率

3．4．2．Western Blot法检测稳定干扰细胞株细胞周期蛋白Cyclin B1

3．4．3 Western Blot法检测稳定干扰细胞株凋亡相关蛋白表达

3．4．4 划痕实验检测稳定干扰细胞株迁移能力的变化

3．4．5 Transwell迁移实验检测稳定干扰细胞株迁移能力

3．5 讨论

总结和工作展望

1．总结

2．展望

参考文献

综述一 转录因子C／EBPβ的结构功能

综述二 C／EBP-β与肿瘤细胞的研究进展

致谢

攻读硕士期间发表的论文和参加的课题