磁性纳米载体的制备及在酶固定化中的应用

摘要

由于具备超顺磁性、生物兼容性和低毒性，磁性Fe3O4纳米材料已成功应用于药物输送系统，高热治疗癌症，磁共振成像（MRI）造影剂，金属和有机材料的分离，通过与不同有机物复合可得到兼具无机纳米粒子和有机物性质磁性颗粒。
　　本论文制备了两种磁性复合载体Fe3O4@chitosan和Fe3O4@OA@DP，并考察了脂肪酶在两种磁性纳米载体上的固定化及青霉素酰化酶在磁性Fe3O4@chitosan纳米载体上的固定化。
　　论文第二章采用共沉淀法在碱性溶液中共沉淀铁盐和壳聚糖，然后经高温处理制备稳定的磁性Fe3O4@chitosan纳米粒子。透射电镜观测的结果显示制备的磁性纳米粒子呈现核-壳结构的球状，平均粒径为25 nm左右。通过傅立叶变换红外光谱检测，磁性Fe3O4@chitosan的谱图中含有氨基和羟基的特征峰，说明壳聚糖成功包覆在磁性Fe3O4纳米粒子表面。以此磁性纳米颗粒为脂肪酶固定化的载体，通过先物理吸附后化学共价连接的方法即(CCEE)法，在最佳固定化条件:脂肪酶浓度0.396mg/mL，时间4h，pH5.0，温度30℃，加入0.1 M EDC时，获得的磁性固定化脂肪酶酶活力回收率可达到75％，载体的蛋白吸附量可达到16.8 mg/g。与游离脂肪酶相比，固定化脂肪酶的最适pH也为9.0，最适反应温度提高了10℃，60℃的半衰期延长了1.5 h，且具有良好的操作稳定性，重复使用十次以后仍保留有70％以上的酶活。最后测定了固定化酶的Km为28.73mM，最大反应速度为2.26 mmol/min，分别是游离酶的1.35倍和0.4倍。
　　论文第三章首先采用共沉淀法制备的磁性Fe3O4纳米粒子，然后用溶胶-凝胶法在其表面包裹一层油酸，得磁性Fe3O4@OA纳米粒子，最后利用多巴胺自聚-氧化作用对复合载体Fe3O4@OA进行表面修饰，制备表面具有大量活性基团-醌基的载体。透射电镜下，颗粒呈球状，粒径约为15nm，分散性良好。通过傅立叶变换红外光谱仪检测，载体表面的油酸的特征峰被改变，说明多巴胺通过与油酸发生反应而包覆在其表面。以磁性Fe3O4@OA@DP纳米粒子为载体，利用聚多巴胺表面醌基与脂肪酶分子中的自由氨基发生Michael addition和Schiffbase formation反应将脂肪酶固定在载体上。实验确定磁性载体Fe3O4@OA@DP固定化脂肪酶的最佳条件为:脂肪酶浓度0.264mg/mL，时间为10h，pH为7.0，所制得固定化脂肪酶酶载量为13.09 mg/g，固定化效率85.5％。与游离酶相比，固定化酶的最适pH从9.0变为8.0，最适反应温度没有变化，均为50℃，固定化酶的热稳定性有较大提高。固定化酶具有优异的操作稳定性，重复使用10次后仍保留有70％的活性。游离酶的Km为8.86 mM，Vmax为2.51 mmol/min，固定化脂肪酶的Km为10.5 mM，Vmax为2.13 mmol/min。
　　论文第四章研究了以磁性Fe3O4@chitosan纳米粒子为载体，通过双功能交联剂碳二亚胺(EDC)的作用，将青霉素酰化酶固定在磁性载体上，在最适固定化条件:20 mg EDC，pH6.0，0.176 mg/mL酶浓度，25℃，固定化时间40 min时，获得的固定化酶的蛋白质收率为69.2％，活力回收率68.2％。比较了游离酶与固定化酶的酶学性质，结果表明，固定化酶的最适反应pH从9.0升高至10.0，且对pH值的变化较稳定，最适反应温度也为45℃，但固定化酶在较大温度范围内(30-55℃)都保持有75％以上的相对酶活。固定化酶的具有良好的操作稳定性，重复使用十次后仍保留有77.8％的酶活。固定化酶和游离酶的米氏常数分别为1.19mM和0.68 mM，表明固定化操作降低了酶与底物的亲和力。
　　最后研究了三种固定化酶的催化反应，探索固定化酶在工业应用中的可能性。选择合成维生素C棕榈酸酯、油酸丁酯和阿莫西林三个反应进行考察，并研究了合成条件对反应转化率的影响。实验结果显示:在异丁醇中，Fe3O4@chitosan脂肪酶催化合成维生素C棕榈酸酯的适宜条件为反应时间18h，50℃，维生素C和棕榈酸的摩尔比为1∶7时，维生素C棕榈酸酯的产率为58.5％。在环己烷中，Fe3O4@OA@DP脂肪酶催化合成油酸丁酯的最佳条件为油酸与正丁醇的摩尔比为1∶1.2，37℃，反应6h，最终转化率为85.93％。在40％的乙二醇中，Fe304@chitosan青霉素酰化酶催化合成阿莫西林的最佳条件为6-APA与HPGM的摩尔比为2.0，pH6.0，25℃，反应14h，合成产率为74.03％。
　　以上结果表明，磁性纳米载体作为固定酶的载体能够有效的提高酶的稳定性，且分离简易，拓宽了酶的工业应用，为其他生物大分子的固定化提供参考。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 磁性纳米载体

1．1．1 磁性纳米载体的简介

1．1．2 磁性纳米载体的制备

1．1．3 磁性纳米载体的稳定和保护

1．1．4 磁性纳米载体的应用

1．2 脂肪酶

1．2．1 脂肪酶简介

1．2．2 脂肪酶的应用

1．3 青霉素酰化酶

1．3．1 青霉素酰化酶简介

1．3．2 青霉素酰化酶的应用

1．4 固定化酶概述

1．4．1 吸附法

1．4．2 包埋法

1．4．3 交联法

1．4．4 共价结合法

1．5 磁性纳米固定化酶的研究概述

1．6 论文选题意义及研究内容

1．6．1 论文选题意义

1．6．2 本文的研究内容

第二章 磁性壳聚糖纳米颗粒的制备及脂肪酶的固定化

2．1 引言

2．2 实验材料与方法

2．2．1 实验试剂和仪器

2．2．2 磁性壳聚糖纳米粒子的制备

2．2．3 磁性壳聚糖纳米粒子表征

2．2．4 蛋白含量测定

2．2．5 脂肪酶活力测定

2．2．6 脂肪酶固定化

2．2．7 脂肪酶固定化条件的研究

2．2．8 脂肪酶的动力学性质的研究

2．3 结果与讨论

2．3．1 材料表征

2．3．2 酶固定化条件的研究

2．3．3 脂肪酶的动力学性质的研究

2．4 本章小结

第三章 磁性油酸纳米颗粒的制备及脂肪酶的固定化

3．1 引言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 实验试剂与仪器

3．2．2 磁性油酸纳米载体的制备

3．2．3 磁性油酸纳米颗粒的表征

3．2．4 蛋白含量测定

3．2．5 脂肪酶活力测定

3．2．6 脂肪酶的固定化

3．2．7 固定化条件的优化

3．2．8 游离酶和固定化酶的酶学性质研究

3．3 结果与讨论

3．3．1 材料表征

3．3．2 固定化条件优化

3．3．3 游离酶及固定化酶的酶学性质研究

3．4 本章小结

第四章 青霉素酰化酶的固定化

4．1 引言

4．2 实验材料与方法

4．2．1 实验试剂与仪器

4．2．2 青霉素酰化酶蛋白含量的测定

4．2．3 青霉素酰化酶活力的测定

4．2．4 青霉素酰化酶的固定化

4．2．5 固定化条件的优化

4．2．6 游离酶和固定化青霉素酰化酶的酶学性质研究

4．3 结果与讨论

4．3．1 固定化条件对固定化酶性能的影响

4．3．2 游离酶和固定化酶的酶学性质研究

4．4 本章小结

第五章 固定化酶的应用

5．1 引言

5．2 实验材料与方法

5．2．1 实验试剂与仪器

5．2．2 维生素C棕榈酸酯的合成

5．2．3 油酸丁酯的合成

5．2．4 阿莫西林的合成

5．3 结果与讨论

5．3．1 维生素C棕榈酸酯合成条件研究

5．3．2 油酸丁酯合成条件研究

5．3．3 阿莫西林合成条件研究

5．4 本章小结

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间所取得的相关科研成果