麋鹿角水溶性蛋白质部位及其活性评价研究

摘要

麋鹿角为鹿科动物麋鹿（Elaphurus davidianus Milne Edwards）的骨化角，是传统补益类中药，其具有壮肾阳、填精髓、强筋骨、益精血等传统功效。研究发现，麋鹿角水提液具有抗衰老与补阳的作用。因此，水溶性物质可能是麋鹿角的功效物质，麋鹿角水溶性物质主要含有蛋白质及多肽类、氨基酸、核苷类、氨基己糖等。然而，目前关于麋鹿角物质基础研究主要集中于无机元素、氨基酸等物质的分析，作为在生命活动中发挥重要作用的蛋白质类、多肽类物质研究尚少。本论文以麋鹿角作为研究对象，对麋鹿角中水溶性蛋白质进行分离纯化，进而研究其细胞活性。
　　1.麋鹿角水溶性蛋白的分离与鉴定
　　（1）麋鹿角水溶性蛋白的分离
　　采用中空纤维膜技术对麋鹿角蛋白质进行分离，共得到四个不同分子量段：MW>100 kDa（ML2，0.17 g/g生药），10 kDa　　（2）麋鹿角水溶性蛋白的鉴定
　　采用Nano LC-IT Orbitrap与PEAKS软件相结合的方法，在麋鹿角水溶性提取物 ML1中共鉴定出360个肽段，经数据库比对，其中216个肽段来源于97个蛋白质，其余144个肽段仅以从头测序方法鉴定；在ML2中共鉴定出185个肽段，经数据库比对，其中85个肽段来源于6个蛋白质，其余100个肽段仅以从头测序方法鉴定；ML3共鉴定出310个肽段，经数据库比对，其中158个肽段来源于11个蛋白质，其余152个肽段仅以从头测序方法鉴定；ML4共鉴定出541个肽段，经数据库比对，其中148个肽段来源于34个蛋白质，其余393个肽段仅以从头测序方法鉴定；ML5共鉴定出577个肽段，经数据库比对，其中370个肽段来源于72个蛋白质，其余207个肽段仅以从头测序方法鉴定；J1共鉴定出440个肽段，经数据库比对，其中236个肽段来源于264个蛋白质，其余204个肽段仅以从头测序方法鉴定；J2共鉴定出396个肽段，经数据库比对，其中162个肽段来源于301个蛋白质，其余234个肽段仅以从头测序方法鉴定；J3共鉴定出455个肽段，经数据库比对，其中193个肽段来源于253个蛋白质，其余202个肽段仅以从头测序方法鉴定；J4共鉴定出709个肽段，经数据库比对，其中27个肽段来源于206个蛋白质，其余682个肽段仅以从头测序方法鉴定；J5共鉴定出581个肽段，经数据库比对，其中93个肽段来源于277个蛋白质，其余488个肽段仅以从头测序方法鉴定；J6共鉴定出462个肽段，经数据库比对，其中241个肽段来源于382个蛋白质，其余221个肽段仅以从头测序方法鉴定；J7共鉴定出375个肽段，经数据库比对，其中86个肽段来源于249个蛋白质，其余289个肽段仅以从头测序方法鉴定。
　　2.麋鹿角水溶性蛋白的生物活性评价研究
　　（1）麋鹿角水溶性蛋白对成骨分化功能的功效评价研究
　　本实验采用MTT法，对麋鹿角水溶性蛋白对大鼠成骨细胞osteoblasts的促增殖活性初步筛选。结果表明，ML1（总水提取物）、ML2（MW>100000）、ML3（10000　　ML1、ML4、ML5对大鼠成骨细胞中COL1A1和Rat osteonectin mRNA的表达均有不同程度的提高，其中ML4对COL1A1和Rat osteonectin mRNA的表达作用效果最明显；J1、J3、J5对大鼠成骨细胞（osteoblasts）中COL1A1和osteonectin mRNA的表达量与对照组相比无显著差异，J2、J4、J6、J7对大鼠成骨细胞中COL1A1和Rat osteonectin mRNA的表达均有不同程度的提高，其中J6对COL1A1和Rat osteonectin mRNA的表达作用效果最明显。
　　（2）麋鹿角水溶性蛋白对神经营养因子的功效评价研究
　　本实验基于 qPCR技术分析了马鹿角总水提物及麋鹿角水溶性蛋白ML1-ML5，J1-J7对大鼠神经胶质瘤细胞C6周期信号通路上关键转录蛋白的影响。研究发现麋鹿角总水提物（ML1）与马鹿角总水提物相比，麋鹿角对各关键转入蛋白mRNA的表达作用效果较明显。ML2-ML5，J1-J7对大鼠神经胶质瘤细胞C6的关键转入蛋白BDNF、NGF、GDNF mRNA的表达均有不同程度的提高，其中ML5对各关键转入蛋白mRNA的表达作用效果最明显，经纯化后的J1-J7蛋白样品中，J5对各关键转入蛋白mRNA的表达作用效果最明显。
　　（3）麋鹿角水溶性蛋白对免疫活性的功效评价研究
　　本论文使用小鼠脾细胞体外培养技术，研究麋鹿角水溶性蛋白 ML1-ML5， J1-J7对小鼠脾细胞的增殖作用，结果表明，麋鹿角水溶性蛋白ML2，即分子量为MW>100000的蛋白质表现出明显的脾细胞增殖作用。浓度最高为0.3 mg/mL时，增殖效果可达135%，结果表明麋鹿角水溶性蛋白对免疫细胞具有一定的促进作用。麋鹿角蛋白样品J1为ML2纯化得到的蛋白样品，其对脾细胞也有显著的增殖作用，对细胞增殖效果与给药浓度有一定关系，其中浓度为1 mg/mL时对细胞增殖效果最好，为150%。

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第一章 文献研究

1. 蛋白多肽类成分分离分析研究

1.1 盐析沉淀法

1.2 等电点沉淀法

1.3 有机溶剂沉淀法

1.4 超滤分离技术

1.5 离子交换层析

1.6 凝胶过滤层析

2. 蛋白质的分析鉴定方法

2.1 Edman降解法

2.2 肽指纹图谱（Peptide Map Fingerprinting）

2.3 基质辅助激光解析电离质谱（MALDI-MS）

2.4 电喷雾电离（ESI-MS）

3. 蛋白质的活性研究

3.1 抗肿瘤作用

3.2 对免疫系统作用

3.3 对性功能作用

3.4 对神经系统作用

3.5 对骨骼生长的影响

4. 本课题的立项背景和意义

5. 本论文的设计路线及其研究内容

第二章 麋鹿角水溶性蛋白的分离与鉴定

第一节 麋鹿角水溶性蛋白的制备

1. 实验材料

2. 实验方法与结果

第二节 麋鹿角水溶性蛋白的鉴定

1. 实验材料

2. 实验方法

3. 结果

4. 讨论

本章小结

第三章 麋鹿角水溶性蛋白的生物活性评价研究

第一节 麋鹿角水溶性蛋白成骨分化功能的功效评价研究

1. 材料与方法

2. 实验方法

3. 结果

4. 讨论

第二节 麋鹿角水溶性蛋白对神经营养因子的功效评价研究

1. 材料与方法

2. 实验方法

3 结果

4 讨论

第三节 麋鹿角水溶性蛋白对免疫活性的功效评价研究

1. 材料与方法

2. 实验方法

3. 结果

4. 讨论

本章小结

全文总结与展望

1. 主要结论

1.1 蛋白质的分离

1.2 蛋白质的鉴定

1.3 麋鹿角水溶性蛋白质的生物活性评价

2. 论文研究特色与创新

3.工作展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文