L-阿拉伯糖异构酶在枯草芽孢杆菌中的芽孢表面展示及酶学性质研究

摘要

D-塔格糖作为低热量甜味剂，代替蔗糖广泛应用于果汁、饮料、口香糖等食品领域，并且具有改善肠道菌群、治疗Ⅱ型糖尿病、降低胆固醇、预防结肠癌等功效。而L-阿拉伯糖异构酶（L-AI）是微生物体内的一种催化醛酮糖间反应的异构酶，可以转化D-半乳糖生成 D-塔格糖。化学法生产 D-塔格糖存在产物纯化复杂、废物处理成本高等问题，因而近来利用L-AI对D-塔格糖的生物法制备以实现工业化生产成为研究的热点。
　　枯草芽孢杆菌作为非致病性的基因工程受体菌，在表达外源蛋白方面已日趋成熟。依靠枯草芽孢杆菌在营养缺乏或环境胁迫下产生的芽孢的独特抗逆性，通过芽孢表面展示技术将具有催化活性的外源蛋白酶展示在芽孢表面，可以大大增加酶制剂的应用条件和范围。因此本研究致力于将乳酸菌来源的L-AI展示在芽孢表面，诱导表达具有高稳定性和催化活性的重组芽孢，并对重组酶的酶学特征及其转化D-半乳糖的情况进行分析。
　　本课题的研究内容和结果主要包括以下几个方面：
　　首先，从泡菜样品中筛选得到具有产酸能力且革兰氏染色鉴定为阳性的乳酸菌，然后利用半胱氨酸-咔唑法初筛到18株能利用D-半乳糖产生D-塔格糖的菌株，再用TLC法对表达L-阿拉伯糖异构酶（L-AI）转化生成D-塔格糖的菌株进行定性和初步定量分析，得到了4株具有明显特征的菌株。通过形态特征和生理生化鉴定以及16S rDNA序列同源性分析，得到了两株具有 L-阿拉伯糖异构酶活性且能产生塔格糖的乳酸菌：Lactobacillus plantarum和Lactobacillus brevis，将其分别命名为Lactobacillus plantarum PC5和Lactobacillus brevis PC14。通过比较分析，选取L. brevis PC14为模板，进一步研究L-阿拉伯糖异构酶的性质。
　　利用L-阿拉伯糖异构酶的编码基因已知序列设计引物，从筛选到的L.brevis基因组中克隆得到1425 bp的araA基因片段，利用质粒载体 pSE380构建重组大肠杆菌菌JM109/pSE-araA，经IPTG诱导后成功表达了重组蛋白，特征条带大小约为55 kDa。采用半胱氨酸-咔唑法，以D-半乳糖为底物，对重组 L-阿拉伯糖异构酶的酶活力进行测定得到酶反应的最适温度为65℃，最适pH值约为6.8，对D-半乳糖的Km及Vmax值分别为77.3 mmol/L和6.0μmol/(L·min)， D-半乳糖的转化率为53％。
　　从Bacillus subtilis168基因组中扩增出芽孢表面展示蛋白CotG的编码基因cotG，与araA同时插入到质粒pHS中构建融合质粒pHS/cotG-araA及B. subtilis DB403基因工程菌B.s/cotG-araA，诱导制备芽孢悬液后经SDS-PAGE和Western Blot分析表明，L-阿拉伯糖异构酶与 CotG实现了融合表达，L-阿拉伯糖异构酶成功展示到了芽孢表面，分子量约75 kDa。重组酶的最适反应温度为65℃，最适pH值为6.8，与E.coli内的重组酶特性一致，但前者表现出了更好的热稳定性和 pH稳定性。芽孢表面展示的L-AI对D-半乳糖的Km及Vmax值分别为48.0 mmol/L和9.7μmol/(L·min)，转化率达62%。重组芽孢回收利用试验表明，经过4次的回收后，L-阿拉伯糖异构酶的酶活力并没有明显的减低。

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第一章 绪 论

1.1 D-塔格糖概述

1.2 L-阿拉伯糖异构酶

1.3 枯草芽孢杆菌芽孢表面展示系统

1.4 本课题的研究目的和意义

1.5 本课题的研究内容和技术路线

第二章 产D-塔格糖乳酸菌的筛选及鉴定

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 结果与讨论

2.5 本章小结

第三章 L-阿拉伯糖异构酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

3.1 引言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 结果与讨论

3.5 本章小结

第四章 枯草芽孢杆菌芽孢表面展示系统的构建及分析

4.1 引言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4 结果与讨论

4.5 本章小结

第五章 全文总结与展望

5.1 主要结论

5.2 展望

参考文献

致谢

在学期间发表的学术论文及其他科研成果

附录