细胞色素CYP2C11基因敲除大鼠模型的构建及表型分析

摘要

人类细胞色素P450已知有57个成员，是参与药物代谢的一类非常重要的代谢酶。研究发现，需要通过细胞色素P450酶进行生物转化的普通处方药占到60％。人类CYP2C亚族中的CYP2C9是人体最重要的药物代谢酶之一。目前已经证实约10%~20%的临床常用处方药物是CYP2C9的底物，包括一些治疗指数较窄的药物，如抗癫痫作用的苯妥英钠，抗凝血作用的华法林等。药物基因组学研究发现，高加索人种中大约有10%~30%属于CYP2C9慢代谢者，亚洲人种中约为3%~5%。如果CYP2C9慢代谢人群接受常人相同剂量的苯妥英钠或华法林的治疗，血药浓度会超出正常范围，很可能发生严重的不良反应。CYP2C11作为大鼠细胞色素P450基因，与人类CYP2C9具有基本相同的底物和组织分布（尤其在雄性大鼠体内），被视为CYP2C9的直系同源基因。CYP2C11基因敲除大鼠模型若缺乏人类CYP2C9相类似的代谢能力，将能较好的模拟CYP2C9慢代谢人群，验证候选药物针对该人群的安全性。本课题组成功构建了CYP2C11基因敲除大鼠模型，并对其基本的表型进行研究，探索了CYP2C11特征性底物甲苯磺丁脲在该模型中的代谢过程，为细胞色素P450基因敲除大鼠模型应用于药物临床前安全评价打下基础。
　　研究主要结果如下：
　　1.CYP2C11基因敲除大鼠模型的培育与鉴定运用CRISPR/Cas9技术构建CYP2C11基因敲除大鼠模型。由南京大学模式动物研究所协助构建该大鼠模型，获得了F0代杂合子(CYP2C11+/-)；将F0代CYP2C11+/-与野生型SD大鼠进行杂交获得F1代杂合子；F1代杂合子间交配后，通过PCR和基因测序方法，筛选出F2代CYP2C11基因敲除大鼠纯合子(CYP2C11-/-)。
　　2.CYP2C11-null大鼠细胞色素P450酶主要亚型的表达利用Western Blot技术鉴定CYP2C11-/-大鼠细胞色素P450酶主要亚型的表达，发现雄性SD大鼠肝脏中有CYP2C11蛋白表达，而雌性SD大鼠中无CYP2C11蛋白表达，雌雄CYP2C11基因敲除大鼠（CYP2C11-null）中均无CYP2C11蛋白表达。CYP2D蛋白表达结果发现，雄性CYP2C11-null显著高于雄性SD大鼠，雌性间无显著性差异；而CYP1A2、CYP3A、CYP2B、CYP2E1以及CYPOR蛋白表达结果发现，CYP2C11-null与SD大鼠相比，同性别组间无显著性差异。
　　3.CYP2C11-null大鼠模型的表型鉴定个体发育观察发现，CYP2C11-null大鼠毛色白色光亮，行为活动表现正常。成年CYP2C11-null大鼠体重和脏器指数与SD大鼠相比无显著性差异。病理组织切片观察表明CYP2C11-null大鼠脏器肝脏、肾脏、脾脏、小肠的形态结构无明显异常，但是睾丸组织切片中发现，CYP2C11-null雄鼠精子数量显著低于SD雄鼠。测定50日龄与120日龄大鼠睾酮浓度发现，与正常SD大鼠相比，120日龄的CYP2C11-null雄性大鼠睾酮浓度显著性下降（P<0.05）。统计比较CYP2C11-null大鼠与SD大鼠繁殖数据发现，CYP2C11-null大鼠平均每胎中产仔数显著下降到SD大鼠数量的55%（P<0.05）。
　　4.CYP2C11-null大鼠肝微粒体对TOL的体外活性分析肝脏微粒体的体外代谢活性检测实验结果发现，CYP2C11-null大鼠肝微粒体对甲苯磺丁脲活性的米氏常数Km显著高于SD大鼠（P<0.05），最大反应速率Vmax和清除率Clint显著低于SD大鼠（P<0.05），得CYP2C11-null大鼠肝微粒体对TOL的体外代谢活性显著降低。
　　5.CYP2C11-null大鼠血浆中甲苯磺丁脲浓度的药代动力学研究SD大鼠与CYP2C11-null大鼠灌胃给予10 mg/kg甲苯磺丁脲发现，CYP2C11-null大鼠与SD大鼠相比，同性别组间药代动力学参数无显著性差异；SD大鼠药动学参数雌性AUC0-t，AUC0-∞，Cmax参数显著高于雄性（P<0.05)，雌性Cl/F显著低于雄性（P<0.05)；CYP2C11-null大鼠药动学参数雌性AUC0-t，AUC0-∞，Cmax参数亦显著高于雄性（P<0.05)，雌性Cl/F显著低于雄性（P<0.05)。
　　综上所述，得到以下结论：
　　本课题组运用CRISPR/Cas9技术成功构建了CYP2C11基因敲除大鼠模型，并且获得了稳定的纯合CYP2C11基因敲除大鼠模型。一般表型鉴定发现除CYP2C11-null大鼠繁殖能力降低外其他表型基本正常。CYP2C11-null大鼠肝微粒体对TOL的代谢活性研究发现，CYP2C11-null大鼠肝微粒体对TOL的活性降低。体内药动实验发现，CYP2C11-null与SD大鼠相比对甲苯磺丁脲的代谢无显著性差异，而CYP2C11-null与SD大鼠均有显著的性别差异。