梯度稀释补料酶膜耦合反应制备牛奶蛋白ACE抑制肽的研究

摘要

为了研究和探索一种制备牛奶蛋白ACE抑制肽的最佳酶膜耦合工艺模型，本文在传统酶解和不补料酶膜耦合最优工艺基础上，对比性探究了等浓度补料、先补料后补水和梯度稀释补料三种酶膜耦合反应过程的稳定性及酶解效果，并对梯度稀释补料酶膜耦合的酶解动力学及稳定运行试验进行了探究。具体研究内容如下：
　　以脱脂奶粉为原料，对5种蛋白酶进行筛选，以ACE抑制率和IC50为考察指标，确定中性蛋白酶为本试验用酶。利用单因素试验、正交试验优化酶解条件，得出最优反应条件为：反应时间60 min、底物浓度11％、加酶量2000 U/g、温度50℃、pH7.0。
　　以膜通量、ACE抑制率和IC50为指标，确定超滤膜分子量为5 kDa。通过不补料酶膜耦合单因素试验，得到酶膜耦合反应最优工艺为：底物浓度7%、加酶量2000 U/g、反应时间100 min、循环泵转速100 r/min，在该条件下蛋白转化率为53.16%、ACE抑制率为76.81%，单位酶产肽量为39.59 g肽·(g酶)-1。与对照比较，蛋白转化率、ACE抑制率、单位酶产肽量分别提高16.99%、18.55%、16.61%。采用高效凝胶过滤色谱法测定超滤液中ACE抑制肽的分子量分布，3 kDa以下组分质量分数为86.60%。
　　绘制三种补料模式下的酶膜耦合反应进程曲线，结果表明，等浓度补料稳定性最差，先补料后补水稳定性较差，梯度稀释补料反应最为稳定。梯度稀释补料反应体系具有透过液浓度高（12.748 mg/mL）、膜通量变化幅度最小（120.403 mL·(m2·min)-1左右）、反应器内蛋白浓度相对稳定（22.637 mg/mL）等优点。对比三种补料模式酶解效果，梯度稀释补料模式蛋白转化率和多肽得率最高，分别是67.58%、67.07%；比先补料后补水模式分别提高12.35%、9.93%；比等浓度补料模式分别提高62.30%、34.03%。因此，梯度稀释补料酶膜耦合反应，稳定性好，酶解效率高，是一种酶解蛋白制取活性多肽的有效手段。
　　在梯度稀释补料酶膜耦合酶解过程中，拟合水解度DH与底物浓度S0及水解时间t的关系，可据此预测其他S0下DH随时间的变化情况。基于对酶解机制的合理假设，建立梯度稀释补料酶膜耦合反应过程动力学模型，得动力学常数Km=69.481 g/L，Vmax=0.752 g·l-1 min-1，对不同底物浓度下梯度稀释补料酶膜耦合反应过程进行模拟，实验值与模拟值吻合较好。通过米氏常数确认最优底物浓度为70 g/L。
　　在动力学模型得出的最佳底物浓度下，梯度稀释补料酶膜耦合反应可持续运行720 min，酶解结果如下：蛋白转化率74.51%、多肽得率75.13%、单位酶产肽量142.27 g肽·(g酶)-1、IC500.77 mg/mL；粗肽产品灰分为8.04%、水分为11.68%、多肽含量为37.40%。
　　综上所述，梯度稀释补料酶膜耦合模型既克服了酶利用率低和反应后期底物不足等问题，又吸取了多种酶膜耦合补料方式的优点，可显著提高酶利用率和生产效率，为工业化生产牛奶蛋白ACE抑制肽提供一种更为有效的方法。