肺癌细胞FAAP20和RAD51C基因敲减对顺铂敏感性的影响

摘要

目的:应用siRNA干扰技术分别和同时共敲减人肺腺癌Calu-1细胞中范可尼贫血（Fanconi anemia, FA）通路FAAP20基因和RAD51C基因，观察该细胞这两个基因敲减后对顺铂敏感性的变化，探讨抑制FA通路DNA的损伤修复功能逆转Calu-1细胞对顺铂（cisplatin，DDP）耐药性的可行性及其效应，并探究FA通路在Calu-1细胞株对顺铂的耐药机制中所起的作用。
　　方法：将针对 FAAP20基因和 RAD51C基因的siRNAs（FAAP20-siRNA和RAD51C-siRNA），用脂质体转染技术将它们分别和同时共转染于人肺腺癌细胞Calu-1细胞。蛋白质印迹法（Western Blotting，WB）检测经 siRNAs转染前后Calu-1细胞FA通路FAAP20和RAD51C蛋白的表达量的变化以证明转染效率，并测定FANCD2蛋白的单泛素化水平；CCK-8(Cell Counting Kit-8)法测定分别和同时共转染前后Calu-1细胞增殖率的变化；Annexin V/PI流式细胞术测定分别和同时共转染前后 Calu-1细胞早期凋亡率的变化；免疫荧光法测定分别和同时共转染前后细胞核内FANCD2核聚小体的形成。
　　结果：与未转染组比较，转染FAAP20-siRNA组和RAD51C-siRNA组后经顺铂处理的Calu-1细胞FA通路中FAAP20蛋白和RAD51C蛋白表达量均明显降低（P均<0.05），证明转染FAAP20-siRNA和RAD51C-siRNA有效，这两种基因被成功敲减。敲减 FAAP20基因后，肺腺癌 Calu-1细胞中经顺铂处理诱导的FANCD2蛋白单泛素化水平显著降低，且形成的FANCD2核聚小体明显下降（P<0.05）。而敲减RAD51C基因后，肺腺癌Calu-1细胞中经顺铂诱导的FANCD2蛋白的单泛素化水平和核聚小体的形成并没有明显改变（P>0.05），证实了FAAP20蛋白作用在FA通路上游，而RAD51C蛋白在FA通路下游行使功能。无论Calu-1细胞的FAAP20基因和RAD51C基因被敲减之前或之后，顺铂处理后的Calu-1细胞增殖率均随浓度升高而下降，呈剂量依赖性。这两个基因敲减之后经顺铂处理的细胞增殖率较基因敲减之前明显下降（P<0.05），细胞早期凋亡率较敲减之前明显增高，而这两个基因同时共敲减较单基因敲减进一步增强了Calu-1细胞对顺铂的敏感性。
　　结论：利用siRNA干扰技术分别敲减肺腺癌细胞Calu-1细胞株FAAP20基因和RAD51C基因可抑制FA通路的DNA损伤修复功能，从而增强Calu-1细胞对顺铂的敏感性，同时敲减这两个基因对顺铂的增敏效应可进一步提高，提示虽然FAAP20和RAD51C分别在FA通路的上下游行使功能，但对DNA损伤修复的作用可能并不完全重叠在一个相同的路径上。本研究结果表明 FAAP20和RAD51C有可能作为分子靶用于克服肺癌细胞对顺铂的耐药以改善治疗效果。

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英文缩写索引

第一章 绪论

1.1前言

1.2论文研究的目的、方法、实验方案和意义

第二章 FAAP20-siRNA、RAD51C-siRNA转染及转染效果，转染对细胞FANCD2单泛素化的影响

2.1实验对象、仪器与材料

2.2实验方法

2.3实验结果

第三章 Calu-1 细胞分别和共转染 FAAP20-siRNA 和RAD51C-siRNA后对FANCD2核聚小体表达的影响

3.1实验对象、仪器与材料

3.2实验方法

3.3实验结果

3.4实验结果分析

第四章 Calu-1细胞分别和共同转染FAAP20-siRNA和RAD51C-siRNA后对细胞增殖率的影响

4.1实验对象、仪器与材料

4.2实验方法

4.3实验结果

第五章 Calu-1细胞分别和共同转染FAAP20-siRNA和RAD51C-siRNA后对细胞凋亡率的影响

5.1实验对象、仪器与材料

5.2实验方法

5.3实验结果

5.4实验结果分析

第六章 讨论

结论与展望

参考文献

综述: 非小细胞肺癌的治疗进展

致谢

攻读硕士期间发表文章