环氧磁性纳米载体固定化NADH氧化酶与脱氢酶构建高效NAD原位再生体系

摘要

氧化还原酶是一类重要的生物催化剂，但通常需要辅酶来完成酶催化反应中的电子转移，而辅酶价格昂贵，且稳定性较低，迄今未见产业化报道。对辅酶进行再生是有效的解决方法。利用NADH氧化酶进行NAD再生具有无副产物，高效催化等优势。本研究拟采用磁性纳米载体固定化 NADH氧化酶（Nox）及耦合甘油脱氢酶（GDH）来实现对NAD的原位再生。由于固定化酶具有磁性，容易回收和再利用，可以达到高效原位再生的目的。主要的研究内容有：磁性纳米载体的制备、固定化酶的制备、固定化过程的优化、固定化酶的表征及其应用。
　　第二章制备了一种环氧基功能化磁性纳米载体，并应用于乙醇脱氢酶（ADH）的固定化。首先，利用共沉淀法制备 Fe3O4纳米颗粒；再利用 SiO2对其表面进行包覆；最后，采用γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（GPS）对颗粒进行化学修饰，即可获得Fe3O4@SiO2-Epoxy纳米颗粒。通过透射电镜（TEM）、傅立叶转变红外光谱仪(FTIR)等进行定性分析，确认该纳米颗粒已成功制备，粒径约为16-24 nm。利用该纳米颗粒对乙醇脱氢酶进行共价固定化。获得的最佳固定化条件为：酶载量5.27 mg/g，固定化pH8.0，固定化温度30℃，缓冲液浓度0.05 M。在最适条件下，酶的固定化率可达90%。经固定化后，乙醇脱氢酶的稳定性显著提高。而且，固定化酶表现出更好的耐热性和良好的重复利用性。在重复利用6次之后，仍保留有超过80%的初始酶活。利用固定化乙醇脱氢酶催化苯乙酮酸转化生成R-扁桃酸，收率可达64%。
　　第三章是利用环氧磁性纳米载体共价固定化 Nox酶，制备出一种稳定性好且容易回收利用的固定化酶。对固定化过程进行了优化，获得最优的固定化条件为：酶载量6.74 mg/g，固定化时间2 h，固定化pH7.0，固定化温度30℃。经过优化后，Nox酶的固定化率高达92%。固定化酶的最适温度为45℃；固定化酶在酸性条件（pH4.0-7.0）下具有更高的活性；固定化酶对底物表现出更好的亲和力；具有良好的重复利用性，在利用9次后，仍保留83%的最初酶活。
　　第四章是采用固定化Nox酶及耦合GDH共同构建NAD再生系统，实现对NAD的再生。同时，将甘油氧化生成有价值的产物1,3-二羟基丙酮（DHA）。经过优化后，确定最佳的偶合反应条件为：酶的比例（w/w）为2:1，温度25℃， pH7.5，甘油浓度100 mM。在最优条件下反应，双酶再生体系可以催化生成3.5 mM DHA，其产量为单酶催化体系的4倍。结果表明，酶偶合再生系统可以实现DHA的高效生产。

目录

声明

第一章 绪论

1.1 辅酶的再生

1.2 NADH氧化酶简介

1.3 依赖NAD+的脱氢酶概述

1.4 酶固定化技术

1.5 磁性纳米粒子概述

1.6 本文选题的目的与意义

第二章 环氧磁性纳米载体的制备及固定化ADH

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 结果与讨论

2.5 本章小结

第三章 环氧磁性纳米载体固定化NADH氧化酶

3.1 引言

3.2 实验仪器与试剂

3.3 实验方法

3.4 结果与讨论

3.5 本章小结

第四章 固定化GDH及耦合Nox构建NAD原位再生系统

4.1 引言

4.2 实验试剂

4.3 实验方法

4.4 结果与讨论

4.5 本章小结

结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文