ERCC1和BRCA2基因共沉默显著增强顺铂对耐药肺癌细胞的细胞毒性

摘要

目的：
　　探讨分别单沉默和共沉默ERCC1和BRCA2基因后顺铂（DDP）对耐药肺腺癌细胞（A549/DDP）的细胞毒性变化及其可能的机制?
　　方法：
　　运用细胞脂质体转染技术将靶向于 ERCC1和 BRCA2基因的siRNAs(ERCC1-siRNA和 BRCA2-siRNA)分别和同时转染于体外培养的A549/DDP细胞。Western Blot检测该细胞转染前后ERCC1和BRCA2蛋白表达水平以确认转染成功。用不同浓度DDP处理A549/DDP细胞，测定ERCC1基因沉默前后FANCD2单泛素化水平（以FANCD2-L/S比值表示），以及BRCA2基因沉默前后BRCA1和RAD51蛋白的表达水平。同时测定DDP敏感肺腺癌细胞(A549细胞)经不同浓度的 DDP诱导后 FANCD2单泛素化、BRCA1和 RAD51蛋白的表达水平。应用 CCK-8法和 Annexin V/PI流式细胞术分别测定 ERCC1和BRCA2基因单沉默及共沉默前后经不同浓度DDP处理的A549/DDP细胞增殖率与凋亡率变化。免疫荧光染色法分别测定ERCC1基因沉默前后的FANCD2核聚小体表达及BRCA2基因沉默前后RAD51小体表达。
　　结果：
　　（1）Western Blot结果显示，应用ERCC1-siRNA和BRCA2-siRNA分别转染A549/DDP细胞后ERCC1和BRCA2蛋白的表达水平均明显低于转染前(P均<0.05)，表明ERCC1-siRNA和BRCA2-siRNA转染有效，ERCC1和BRCA2基因被沉默。（2）Western Blot和免疫荧光法结果显示，A549/DDP细胞的FANCD2单泛素化水平、BRCA1和RAD51蛋白的表达水平随着DDP浓度的增加总体上呈上升趋势，而A549细胞并未显示出这一趋势，提示范可尼贫血（FA）通路和同源重组修复（HRR）通路参与了A549/DDP细胞对DDP的耐药机制。ERCC1基因沉默后经DDP处理的FANCD2蛋白单泛素化水平和核聚小体表达较沉默前均显著下降(P均<0.05)；BRCA2基因沉默后经 DDP处理的 BRCA1和 RAD51蛋白表达及RAD51核聚小体表达水平亦较沉默前显著下降(P均<0.05)，表明FA 通路和HRR通路DNA修复功能受到抑制。（3）CCK-8法和流式细胞术测定结果示，分别沉默ERCC1基因和BRCA2基因后均能增强DDP对A549/DDP细胞的增殖抑制作用和促凋亡作用(P均<0.05)，这两个基因共沉默较单基因沉默可进一步增强DDP对A549/DDP的细胞毒性作用(P均<0.05)?这一结果表明同时沉默ERCC1和BRCA2基因在增强DDP对耐药肺癌细胞的杀瘤效应方面具有协同作用。
　　结论：
　　沉默ERCC1与BRCA2基因均可逆转耐药肺癌细胞A549/DDP对DDP的耐药性，且两个基因共沉默这种逆转DDP耐药的作用更明显。这种逆转耐药作用主要是通过抑制FA通路和HRR通路的DNA损伤修复功能功能来实现的。

目录

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英文缩写索引

第一章 绪 论

1.1 前言

1.2 实验研究目的、方法、方案的选择及临床意义

第二章 ERCC1-siRNA、BRCA2-siRNA转染、验证转染效果及DDP诱导的DNA修复蛋白表达

2.1 实验细胞株、仪器与试剂

2.2 实验方法及详细流程

2.3 Western Blot实验结果

第三章 ERCC1-siRNA和BRCA2-siRNA转染分别对A549/DDP细胞FANCD2及RAD51核聚小体表达的影响

3.1 实验细胞株、仪器与试剂

3.2 实验方法及详细流程

3.3 免疫荧光染色法实验结果

第四章 ERCC1-siRNA和BRCA2-siRNA单转染及共转染对A549/DDP细胞增殖率的影响

4.1 实验细胞株、仪器与试剂

4.2 实验方法及详细流程

4.3 CCK-8法实验结果

第五章 ERCC1-siRNA和BRCA2-siRNA单转染及共转染对A549/DDP细胞凋亡率的影响

5.1 实验细胞株、仪器与试剂

5.2 实验方法及详细流程

5.3 Annexin V/PI流式细胞术实验结果

第六章 实验结果分析

讨论

结论与展望

参考文献

综述:顺铂抗癌的作用机制、临床应用及未来

致谢

攻读硕士期间发表文章