ALKBH5经Wnt/β-catenin信号通路抑制胰腺癌细胞上皮间质转化

摘要

研究目的：
　　探究RNA m6A去甲基酶ALKBH5（alkB homolog5，ALKBH5）在人胰腺癌细胞株中的表达，以及其对胰腺癌细胞迁移、侵袭和上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影响，并探究其作用的可能分子机制及其临床意义。
　　研究方法：
　　1.在ONCOMINE数据库中搜索对比正常胰腺组织和胰腺癌中ALKBH5的表达水平，研究其临床意义。采取Real-time PCR和Western blot检测ALKBH5在三种人胰腺癌细胞株中的表达。
　　2.根据ALKBH5 shRNA的序列，构建sh-ALKBH5干扰质粒pLKO.1-sh-ALKBH5（sh-ALKBH5），并在mRNA和蛋白质水平鉴定其干扰效果；将ALKBH5的CDS区序列克隆至真核表达载体p3xFLAG-CMV-24，构建ALKBH5的过表达质粒3xFlag-ALKBH5，并在mRNA和蛋白水平鉴定ALKBH5的过表达效果。
　　3.将干扰质粒sh-ALKBH5分别转入相对高表达ALKBH5的胰腺癌细胞株PaTu8988和相对低表达ALKBH5的SW1990中；将过表达质粒3xFlag-ALKBH5分别转入相对相对高表达ALKBH5的胰腺癌细胞株BxPC3细胞和相对低表达ALKBH5的SW1990中，采用Transwell迁移和侵袭实验检测ALKBH5表达量对胰腺癌细胞株迁移和侵袭的影响。
　　4.将干扰质粒sh-ALKBH5分别转入相对高表达ALKBH5的胰腺癌细胞株PaTu8988和相对低表达ALKBH5的SW1990中；将过表达质粒3xFlag-ALKBH5分别转入相对相对高表达ALKBH5的胰腺癌细胞株BxPC3细胞和相对低表达ALKBH5的SW1990中，采用Western blot检测EMT主要指标蛋白、转移相关蛋白基质金属蛋白酶2（MMP2）和基质金属蛋白酶9（MMP9）及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白水平的变化；采用双荧光素酶报告基因检测实验测定细胞内β-catenin/TCF-4的转录活性。
　　研究结果：
　　1.在ONCOMINE数据库中搜索对比正常胰腺组织和胰腺癌中ALKBH5的表达水平，发现与正常胰腺组织相比，胰腺癌中ALKBH5的表达水平下降。ALKBH5差异性表达于3种胰腺癌细胞株，在PaTu8988细胞和BxPC3细胞中表达相对较高， SW1990中ALKBH5的表达水平相对较低。
　　2.菌液PCR及上海生工测序鉴定结果表明， sh-ALKBH5和3xFlag-ALKBH5质粒构建成功。本实验所构建的sh-ALKBH5质粒能够有效地抑制胰腺癌PaTu8988和SW1990细胞中ALKBH5的表达；本实验所构建的3xFlag-ALKBH5质粒能够高效地在SW1990和BxPC3细胞中表达ALKBH5。
　　3.与对照组对比，下调ALKBH5的表达后，PaTu8988和SW1990细胞的迁移及侵袭能力增强。相反，上调ALKBH5的表达后，SW1990和BxPC3细胞的迁移及侵袭能力均减弱。
　　4.下调ALKBH5的表达后，PaTu8988和SW1990细胞的EMT能力增强，MMP2和MMP9的蛋白表达水平增多，抑制GSK-3β的活性从而抑制β-catenin的磷酸化，细胞内β-catenin积聚，激活Wnt/β-catenin信号通路以及促进胰腺癌细胞内的β-catenin/TCF-4的转录活性；相反，上调ALKBH5的表达后，SW1990和BxPC3细胞的EMT能力减弱，MMP2和MMP9的蛋白表达水平减少，增强GSK-3β的活性从而促进β-catenin的磷酸化，导致细胞内β-catenin减少，抑制Wnt/β-catenin信号通路以及抑制胰腺癌细胞内的β-catenin/TCF-4的转录活性。
　　研究结论：
　　1.ALKBH5通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制胰腺癌细胞迁移、侵袭和上皮间质转化的生物学功能，具体作用机制需要更深入的研究。
　　2. ALKBH5在胰腺癌细胞中迁移、侵袭和上皮间质转化的生物学功能中扮演抑癌基因的角色。

目录

声明

英文缩略词表

第一章 绪 论

1.1 研究背景

1.2本研究的目的、内容、技术路线

第二章 检测ALKBH5的表达水平及载体的构建与鉴定

2.1 实验材料与实验方法

2.2 实验结果

2.3 讨论

第三章 ALKBH5抑制胰腺癌细胞迁移和侵袭

3.1 实验材料与实验方法

3.2 实验结果

3.3 讨论

第四章 初步探索ALKBH5对胰腺癌细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响

4.1 实验材料与实验方法

4.2 实验结果

4.3 讨论

第五章 工作总结与展望

5.1 工作总结

5.2 工作展望

参考文献

攻读硕士期间发表论文

致谢