人源DNA聚合酶δ之p50亚基泛素化修饰位点的分析

摘要

为了保证染色体结构的完整性和遗传的稳定性，细胞内除了有各种分工明确的损伤修复途径外，它还进化出一种跨损伤修复的损伤耐受机制，涉及一种被广为深入研究的有错跨损伤合成途径，即：通过低保真跨损伤合成聚合酶临时取代复制性DNA聚合酶δ(DNA polymeraseδ,Polδ)，旁路通过受损碱基，使得由于DNA损伤而导致S-期暂停的复制叉进程得以恢复，这种复制聚合酶与跨损伤合成聚合酶之间的转换构成了有错跨损伤修复途径的核心，但目前对该途径所涉及的聚合酶转换机制仍存在争议。有观点认为，Polδ和Polζ的催化亚基通过共享辅助亚基在损伤点（域）进行了转换，但这种模型无法解释其它跨损伤合成(translesion synthesis,TLS)聚合酶在损伤点（域）与Polδ是如何进行交换的。还有一种观点认为，增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的泛素化－去泛素化修饰介导了跨损伤合成途径中的聚合酶转换。但相反的研究表明，被单泛素化修饰了的PCNA-Ub1并不影响复制聚合酶Polδ的活性，也未破坏Polδ-PCNA的捆绑结构，且对TLS聚合酶Polη的活性无增强作用；类似的研究也表明，无论是未经修饰的PCNA还是被单泛素化了的PCNA-Ub1，它们对TLS聚合酶Polζ和REV1的活性均并无任何刺激作用，因此，PCNA的单泛素化修饰并不是聚合酶转换的核心。
　　本实验室前期研究表明，泛素E3连接酶RNF8能够介导Polδ的p50亚基单泛素化修饰反应，可能在激活聚合酶转换过程中起关键作用，但对p50单泛素化修饰的详细机制未知，如：涉及细胞内的p50泛素化修饰途径、p50亚基的单泛素化修饰位点、修饰后的p50与TLS聚合酶的互作反应以及如何介导跨损伤合成途径中的聚合酶转换，等。
　　作为国家自然科学基金项目研究内容的一部分，本硕士论文研究主要针对DNA聚合酶Polδ小亚基p50的泛素化修饰位点进行筛查确认。通过已发表的多种泛素化修饰位点预测软件，首先对p50亚基可能被泛素分子特异性结合的赖氨酸残基K位点进行预测；再根据预测的K的分布情况，分别构建、表达并纯化出截短了的4个p50多肽片段，每个片段分别含4-5个分值较高的K；通过以各p50片段蛋白为基质的体外泛素化反应分析，初步确定出p50最有可能发生单泛素化修饰反应的位点（之一）为第145位的赖氨酸残基（K145）。另外，通过对被单泛素化修饰了的p50-Ub1蛋白直接进行质谱分析，又鉴定出p50被单泛素化修饰的另外一个位点K267。针对以上的实验结果，我们又对这两个位点进行了（分别和全部的）诱变，通过以诱变体蛋白为基质的体外泛素化反应实验，最终确认K145和K267同为p50被泛素化修饰的位点。
　　本论文的研究为揭示跨损伤修复途径中聚合酶Polδ与TLS聚合酶交换的新机制提供了研究基础，为今后以Polδ作为一种小分子抑制剂的潜在新靶标、设计新的肿瘤诊断方法和治疗手段来抗击癌症疾病提供理论参考。

目录

声明

第一章 绪论

1.1 泛素化修饰简介

1.2 DNA聚合酶δ

1.3跨损伤修复途径中DNA聚合酶δ与TLS聚合酶的转换机制

1.4 立题依据与研究内容及意义

第二章 实验材料及主要仪器设备

2.1实验材料

2.2主要仪器设备

2.3主要溶液及试剂的配制

第三章 实验方法

3.1 PCR反应

3.2 PCR产物纯化

3.3双酶切反应

3.4 胶回收

3.5 连接反应

3.6感受态细胞的制备

3.7转化

3.8挑斑及鉴定

3.9小规模的质粒提取

3.10双酶切验证

3.11重组质粒转化

3.12重组蛋白诱导表达的可溶性分析

3.13重组蛋白诱导表达条件的筛选

3.14重组蛋白原核表达并经Ni-柱的初步纯化

3.15 MonoQ离子交换柱进一步纯化

3.16 SDS-PAGE

3.17 Western-blot

3.18体外泛素化修饰反应分析

第四章 实验结果

4.1 p50单泛素化修饰现象的确认

4.2 p50蛋白泛素位点的预测分析

4.3重组质粒pET-28a-Ti(i=1~4)及pET-28a-p50的构建

4.4重组蛋白的表达纯化

4.5泛素位点的初步确定

4.6 泛素位点的确认

总结与讨论

参考文献

硕士期间学术研究成果

致谢

附录