基于量子点功能化生物传感器的转基因大豆检测研究

摘要

自从第一例转基因大豆成功转化以来，转基因大豆品种和种植面积日渐增加，其安全性及对环境的影响等问题已变成了人们关注的焦点。因此，为了保障消费者的权益，转基因大豆检测已成为转基因研究的必要环节，发展快速、灵敏、高通量、自动化的新型检测方法，已成为国内外转基因产品检测方法的热点，对推进转基因技术发展，保障转基因大豆的安全监管和维护社会稳定具有极其重要的意义。本论文以量子点为信号材料，构建光电、荧光生物传感器，并将其应用于转基因大豆35S启动子（Promoter of cauliflower mosaic virus35s，P35S）或（和）NOS终止子(Terminatornopalinesynthase，TNOS)的检测中，并通过所设计方法之间的比较，选择最优设计方案，结合机器视觉技术开发检测转基因大豆的装置，以达到快速、灵敏、高通量、自动化检测的目的。具体研究内容如下:
　　1、以制备的金纳米粒子-还原氧化石墨烯(Gold nanoparticles-reduce grapheneoxide，AuNPs-rGO)纳米功能材料为基底材料，连接带有-SH的DNA探针(probe1)，制得固定探针;采用静电吸附法将大量的CdTe量子点(Quantum dots，QDs)均匀的负载在SiO2表面，形成核-壳结构SiO2@CdTe纳米球，然后通过酰胺反应与-NH2修饰的DNA探针(probe2)连接，制得捕获探针;固定探针、捕获探针分别与P35S目标DNA的两端特异性杂交，形成“三明治”结构的光电化学生物传感器，应用于转基因大豆中P35S的检测。研究发现，SiO2@CdTe纳米球的光电流信号是CdTe QDs的2.5倍，rGO-AuNPs具有大的比表面积和出色的导电性能，该传感器以核-壳结构的SiO2@CdTe纳米球和rGO-AuNPs纳米复合物作为双重信号放大策略，DNA探针作为识别元件，具有良好的选择性、灵敏度、重现性和稳定性。在优化条件下，P35S的浓度与该传感器的光电流强度呈现良好的正相关性，线性范围为0.1pM～500pM，检出限为0.05pM(S/N=3)，并用于实际转基因大豆样品检测，为光电化学传感技术在转基因检测的应用提供了新思路。
　　2、采用常压水热法制备荧光性能优良、表面富含-COOH基团的氮杂石墨烯量子点(Nitrogen-doped graphene quantum dots，NGQDs)作为信号分子，通过酰胺反应与带有-NH2的DNA探针(probe1)连接，制得捕获探针;所制备的粒径均匀的银纳米粒子（Silver nanoparticles，AgNPs）通过Ag-S键与带有-SH基团的DNA探针(probe2)结合，制得固定探针;固定探针、捕获探针分别与P35S目标DNA的两端进行特异性杂交，从而拉近NGQDs-AgNPs的距离，促使荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）的发生，构成均相荧光生物传感体系。研究发现，NGQDs的荧光发射光谱和AgNPs的紫外吸收光谱具有大幅重叠的特性，在优化条件下，P35S的浓度与NGQDs的荧光强度呈现良好的负相关性，线性范围为0.1nM～500nM，检出限为0.03nM(S/N=3)。该荧光生物传感体系的检测过程在均相溶液中进行，无需分离，操作步骤简单，且具有良好的选择性和重现性，并成功将其应用于转基因大豆的检测，为转基因检测提供了一种有效途径。
　　3、采用改进的St(o)ber法分别制备SiO2纳米球内部包裹绿色CdTe QDs(greenQDs，gQDs)、红色CdTe QDs(red QDs，rQDs)的核-壳结构gQDs@SiO2、rQDs@SiO2纳米复合材料，通过静电吸附法在其表面分别吸附大量的gQDs、rQDs，从而得到荧光性能优良的gQDs@SiO2@gQDs、rQDs@SiO2@rQDs荧光微球;制备的荧光微球gQDs@SiO2@gQDs、rQDs@SiO2@rQDs通过酰胺反应分别与-NH2修饰的TNOS捕获探针(Capture probes of TNOS，CT)和P35S捕获探针(Capture probes of P35S，CP)共价结合，制得gQDs@SiO2@gQDs-CT和rQDs@SiO2@rQDs-CP;以具有优良磁性的核-壳型金磁微粒(Fe3O4@Au magneticbeads，MBs)为磁控材料，通过Au-S键分别与修饰-SH的TNOS固定探针(Fixingprobes of TNOS，FT)、P35S固定探针(Fixing probes of P35S，FP)结合，制得MBs-FT和MBs-FP; gQDs@SiO2@gQDs-CT、MBs-FT分别与TNOS的两端特异性杂交;rQDs@SiO2@rQDs-CP、MBs-FP分别与P35S的两端特异性杂交;利用MBs的磁性对目标DNA所连接上的荧光微球进行分离，随后检测剩余溶液的荧光强度，构建了磁控生物传感体系。在优化条件下，TNOS和P35S的浓度与所剩溶液中的荧光强度呈现良好的负相关性。线性范围分别为0.2nM～800nM和0.1nM～800nM，检出限分别为0.07nM和0.04nM(S/N=3)。成功将构建的磁控生物传感体系用于TNOS和P35S的同时检测，为转基因多目标检测提供了新思路。
　　4、通过控制合成时间，分别制备发射绿色荧光的gQDs和发射红色荧光的rQDs; gQDs、rQDs分别通过酰胺反应与-NH2修饰的TNOS捕获探针(CT)和P35S捕获探针(CP)共价结合，制得gQDs-CT和rQDs-CP纳米生物探针（荧光信号“开”）;MWCNTs@GONRs同时作为两种纳米生物探针的荧光淬灭剂，使其荧光同时淬灭（荧光信号“关”）;向所构建的传感体系中同时加入目标物TNOS和P35S时，通过目标物和对应的纳米生物探针之间DNA特异性杂交互补配对，形成双链DNA，从而使纳米生物探针从MWCNTs@GONRs表面脱落，发生荧光恢复（荧光信号“开”）。在优化条件下，TNOS和P35S的浓度与荧光强度呈现良好的正相关性。线性范围分别为1.5nM～1000nM和1.2nM～900nM，检出限分别为0.5nM和0.35nM(S/N=3)。该传感体系具有良好的选择性、重现性和稳定性，为转基因多重目标的同时检测奠定了基础。
　　5、通过以上几种转基因检测方法的比较，搭建了基于两种颜色CdTe QDs和机器视觉技术的转基因TNOS和P35S检测装置。采用荧光“开-关-开”效应的生物传感体系对目标物进行显色，通过图像信息采集、图像分割、图像特征数据处理对实验结果进行分析。该方法可以实现对TNOS和P35S的快速检测，而且操作简单、自动化、智能化，省去了繁琐的实验数据处理过程，其准确度高、时效性好，是转基因检测的一个重要突破。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 转基因作物的发展现状

1．2 转基因作物的安全性问题及其标识管理

1．2．1 转基因作物的安全性问题

1．2．2 转基因作物的标识管理

1．3 GMO及其产品检测方法

1．3．1 基于蛋白质的检测技术

1．3．2 基于外源DNA的检测技术

1．4 本研究的目的意义

1．5 本研究的主要内容

第二章 基于SiO2@CdTe信号放大的光电化学传感器的构建及对转基因大豆中P35S的检测

2．1．1 药品与试剂

2．1．2 仪器设备

2．1．4 probe2-SiO2@CdTe捕获探针的制备

2．1．5 修饰电极的制备

2．1．6 光电化学实验方法

2．1．7 PEC传感器检测机理

2．1．8 PEC传感器测定P35S启动子

2．1．9 实际转基因大豆样品检测

2．2 结果与讨论

2．2．2 probe2-SiO2@CdTe信号探针的表征

2．2．3 不同修饰电极的EIS分析

2．2．4 不同修饰电极的光电流响应

2．2．5 实验条件优化

2．2．6 PEC传感器应用于P35S启动子的检测

2．2．7 传感器的选择性、重现性以及稳定性

2．2．8 PEC传感器应用于实际样品转基因大豆中P35S启动子的检测

2．3 本章小结

第三章 基于AgNPs-NGQDs的FRET传感体系对转基因大豆中P35S的检测

3．1 实验部分

3．1．1 药品与试剂

3．1．2 仪器设备

3．1．3 NGQDs-probe1捕获探针的制备

3．1．4 AgNPs-probe2固定探针的制备

3．1．5 AgNPs-NGQDs的FRET传感体系的构建及对P35S的检测

3．1．6 FRET传感体系对实际转基因大豆样品的检测

3．2 结果与讨论

3．2．1 NGQDs的表征

3．2．2 AgNPs的表征

3．2．3 纳米复合探针的表征

3．2．4 检测原理及实验条件优化

3．2．5 对P35S启动子的荧光检测

3．2．6 传感体系的选择性和重现性

3．2．7 实际转基因大豆样品的检测

3．3 本章小结

第四章 金磁微粒联合荧光微球构建的磁控生物传感体系对转基因大豆中P35S和TNOS的同时检测

4．1 实验部分

4．1．1 药品与试剂

4．1．2 仪器设备

4．1．3 MBs的制备

4．1．4 QDs@SiO2@QDs的制备

4．1．6 gQDs@SiO2@gQDs-CT和rQDs@SiO2@rQDs-CP的制备

4．1．7 磁控生物传感体系对启动子P35S和终止子NOS的同时检测

4．2 结果与讨论

4．2．2 gQDs@SiO2@gQDs和rQDs@SiO2@rQDs的表征

4．2．3 多功能纳米复合生物探针的表征

4．2．4 磁控纳米生物复合物的检测原理

4．2．5 检测条件优化

4．2．6 对启动子P35S和终止子NOS的同时检测

4．2．7 传感体系的选择性和重现性

4．2．8 实际转基因大豆中TNOS和P35S的同时检测

4．3 本章小结

第五章 基于碳纳米材料对QDs的荧光“开-关-开”效应构建生物传感体系对转基因大豆中P35S和TNOS的同时检测

5．1 实验部分

5．1．1 药品与试剂

5．1．2 仪器设备

5．1．3 MWCNTs@GONRs的制备

5．1．5 基于荧光“开-关-开”效应构建的生物传感体系对P35S和TNOS的同时检测

5．2 结果与讨论

5．2．1 多色量子点标记的纳米生物探针的表征

5．2．2 MWCNTs@GONRs吸附纳米生物探针的表征

5．2．3 基于荧光“开-关-开”传感体系的检测原理

5．2．4 检测条件的优化

5．2．5 对终止子TNOS和启动子P35S的同时检测

5．2．6 传感体系的选择性、重现性和稳定性

5．2．7 传感体系对实际转基因大豆中TNOS和P35S的同时检测

5．3 本章小结

第六章 基于QDs荧光成像和机器视觉技术同时检测转基因大豆中TNOS和P35S

6．1 实验材料

6．1．1 实验试剂及显色原理

6．1．2 机器视觉检测系统

6．1．3 试剂样本

6．2 图像采集与分析

6．2．1 图像采集

6．2．2 图像分割

6．2．3 图像特征数据分析

6．3 结果与分析

6．3．1 对P35S的检测分析

6．3．2 对TNOS的检测分析

6．4 本章小节

第七章 结论与展望

7．1 结论

7．2 展望

参考文献

致谢

攻读博士学位期间取得的学术成果