大鼠中CYP2C11基因敲除对血压及华法林药动药效学影响研究

摘要

细胞色素P450酶系广泛存在于细菌、真菌、动物及植物体内，它是外源性化合物的主要代谢酶，负责超过80％的药物代谢。CYP2C是P450中一个重要的亚家族，人类CYP2C亚家族被研究较多的成员有CYP2C9和CYP2C19，负责代谢约20%的药物。哺乳动物体内CYP2C酶参与肾脏中和血管平滑肌细胞中由花生四烯酸合成二十碳环氧烯酸（EETs）的过程。EETs是血管松弛的重要介质，主要作用是在阻力动脉中调节组织血流量，是参与血压调节的重要物质。因此学界推测CYP2C酶在体内可以通过上调EETs的生成来降低血压，如何用实验直接证明CYP2C在血压调节中的作用，是尚待解决的问题。此外，人类CYP2C9是代谢华法林的重要酶，由于该酶基因存在遗传多态性，华法林使用者可被分为快代谢人群（EM）和慢代谢人群（PM）。慢代谢人群使用该药时常出现药物蓄积和过量现象，因此能否构建一个可以模拟慢代谢人群中华法林代谢的动物模型，是迫切需要解决的一个问题。
　　本实验室前期构造了 CYP2C11大鼠基因敲除模型（CYP2C11-null）该基因（大鼠CYP2C11基因）与人类 CYP2C9基因相比具有85%的同源性，被认为是人类CYP2C9在大鼠中的直系同源基因。我们尝试使用该模型来研究上述两个问题。我们比较了CYP2C11-null和SD两种大鼠的基础血压，及其在高盐饮食诱导下血压的变化，并评价了CYP2C11-null大鼠中参与EETs代谢相关的其他P450酶的表达。我们还比较了CYP2C11-null和SD两种大鼠对华法林体内、体外的药物代谢差异，评价了两种大鼠中华法林抗凝血作用。
　　研究结果：
　　1.CYP2C11-null大鼠模型血压的变化及表型鉴定实验使用颈动脉测血压的方法对比CYP2C11-null大鼠与SD大鼠的血压差别；用同样方法研究了用高盐饮食诱导后两种大鼠的血压差异。结果普通饮食下，CYP2C11-null大鼠血压与SD大鼠血压无显著差异；在高盐诱导下，CYP2C11-null大鼠血压甚至低于 SD野生型大鼠。病理组织切片和脏器指数分析结果发现，高盐饮食对两种大鼠肾脏均造成不同程度损伤，但其他主要脏器无明显影响。在该结果的基础上，我们检测了CYP2C11-null大鼠中与血压调节相关的其他P450基因的表达。结果发现， CYP2C11-null大鼠肝肾微粒体中CYP4A1蛋白表达较SD鼠显著增加，而CYP2J2蛋白表达无显著变化；CYP2C11-null大鼠肝脏 CYP2C23、CYP2C24的 mRNA表达降低。
　　2.CYP2C11-null大鼠模型对华法林体外活性研究实验提取了CYP2C11-null雄鼠与SD雄鼠的肝微粒体，进行华法林的体外孵育后，采用高效液相色谱（HPLC）进行华法林的定量。与SD大鼠相比，CYP2C11-null大鼠肝微粒体对华法林活性Km值显著升高（P<0.05），最大反应速率Vmax及清除率Clint降低。实验结果表明CYP2C11-null大鼠肝微粒体对华法林的体外代谢活性降低。
　　3.华法林在 CYP2C11-null大鼠体内药代动力学的研究实验使用了成年CYP2C11-null与SD大鼠，灌胃给药（2 mg/kg华法林）后立即检测其72小时内血药浓度变化，并计算药代动力学参数。实验结果发现同性别组间，达峰时间CYP2C11-null雄鼠较SD雄鼠显著延迟，且清除率也显著降低（P<0.01），AUC(0-t)、AUC(0-∞)、Cmax数值有升高但统计学上无显著差异。实验结果表明，在CYP2C11酶缺失的状态下CYP2C11-null雄鼠吸收速率变慢，清除率也降低。
　　4.华法林在 CYP2C11-null大鼠体内药效学的研究实验对成年CYP2C11-null大鼠及SD大鼠给药2 mg/kg，然后使用凝血酶原时间试剂盒检测凝血酶原时间(PT)及计算国际标准化比率(INR)。实验结果发现CYP2C11-null大鼠PT值上升较SD大鼠快，且数值高于SD大鼠，INR值变化规律与PT值基本一致。以上结果表明 CYP2C11-null大鼠血浆中华法林抗凝血作用较强，间接证明了CYP2C11-null大鼠与SD大鼠相比对华法林代谢能力减弱。
　　综上所述，得到以下结论：
　　本论文研究发现在大鼠体内P450相关的血压调控机制中，CYP2C11酶并不占主导作用，其他 P450酶的诱导上调可在功能上补偿 CYP2C11酶的缺失。此外，CYP2C11-null大鼠对华法林的代谢能力降低，该模型具有模拟华法林慢代谢人群的潜力。

目录

声明

缩略词英文注释表

第一章 绪 论

1.1细胞色素P450概述

1.2 转基因动物的研究进展

1.3 CYP2C11基因敲除大鼠模型的构建与培育

1.4 本课题立项背景及意义

1.5 本课题主要研究内容

第二章 CYP2C11基因敲除对大鼠血压的影响研究

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨 论

2.5 本章小结

第三章 CYP2C11-null大鼠肝微粒体对华法林体外代谢的研究

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3实验结果

3.4讨论

3.5 本章小结

第四章 CYP2C11-null大鼠中华法林体内药代动力学研究

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

4.5 本章小结

第五章 CYP2C11-null大鼠中华法林药效学研究

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 实验结果

5.4 讨论

5.5 本章小结

第六章 全文总结与展望

6.1 主要结论

6.2 本课题创新点

6.3 工作展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文