水蜜桃炭疽病拮抗酵母菌的筛选、初步应用及其生防机理的研究

摘要

水蜜桃是我国重要的水果之一，但由于在采摘、运输和贮藏等环节的技术不成熟及病原菌的侵染，导致水蜜桃采后损失严重。大量报道证实拮抗酵母可以安全有效的抑制果蔬采后病害。本课题筛选出一株有效抑制水蜜桃炭疽病的拮抗酵母菌，探究其主要生防机制，并将其制成冻干粉应用在水蜜桃贮藏保鲜阶段。 本论文的主要研究内容有： （1）从在桃园分离到的53株酵母菌株中，通过体外筛选和体内筛选得到可以有效抑制水蜜桃炭疽病病原菌胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）的一株酵母菌Y23；通过对其进行分子特征等鉴定，鉴定其为柠檬形克勒克酵母（K. apiculata）。 （2）通过水蜜桃体内实验得出，K. apiculata Y23抑制C. gloeosporioides的最佳浓度为1×108 cells/mL；在液体培养基和病原菌孢子共培养后，发现K. apiculata Y23可以显著抑制C. gloeosporioides孢子萌发；同时发现K. apiculata Y23可能对C. gloeosporioides菌丝具有重寄生作用，从而抑制病原菌生长；通过对峙培养实验发现，K. apiculata Y23可以分泌抑菌物质抑制C. gloeosporioides菌丝生长，并可以抑制C. gloeosporioides产孢的数量和质量；通过倒扣培养实验发现，K. apiculata Y23可以产生挥发性抑菌物质抑制C. gloeosporioides生长，并通过GC-MS方法对抑菌物质进行了确定，主要有苯乙醇、乙酸异戊酯、丙酸乙酯、异戊醇和乙酸苯乙酯；水蜜桃经K. apiculata Y23处理后相关抗性酶活性及总酚和类黄酮含量均有所提高，说明提高宿主防卫反应也是其抑菌机理之一。 （3）通过K. apiculata Y23与纤维素酶共培养，推测K. apiculata Y23可以分泌蛋白酶降解纤维素酶，作为氮源生长繁殖，通过抑制纤维素酶活性减缓病原菌对宿主细胞壁的破坏，进而延长果实保鲜时间及贮藏期。由此说明K. apiculata Y23降解病原菌胞外酶可能是其一种新的抑菌机理。 （4）对K. apiculata Y23活性冻干粉制备过程的离心参数进行了优化，最佳离心参数为离心转速8000 rpm/min，离心时间20 min；并对K. apiculata Y23活性冻干粉的保护剂进行了筛选，发现蔗糖、菊粉和谷氨酸钠这三种保护剂的冻干效果最好；然后对三种效果最好的保护剂进行复配，发现10%菊粉+5%蔗糖+7.5%谷氨酸钠的组合效果最好， K. apiculata Y23存活率可达85.32%；最后在K.apiculata Y23活性冻干粉保存实验中得出-20℃更适宜其保存，在6个月时存活率仍有50.06%。 （5）对K. apiculata Y23活性冻干粉剂分别采用浸泡法和喷洒法处理水蜜桃果实，研究这两种应用方法在水蜜桃果实贮藏保鲜方面的影响，无菌水为对照，结果显示：两种处理方法对水蜜桃果实贮藏期间的病害腐烂情况有明显的抑制作用，在贮藏7 d时，腐烂指数分别仅为3.42％和5.61％；而且，两种生防菌剂在水蜜桃果实贮藏期间的失重率、硬度、可溶性固形物含量、果皮细胞膜透性、维生素C含量、总酸含量等方面均起到一定的积极保护作用。表明这K. apiculata Y23的这两种处理方法对水蜜桃果实采后贮藏保鲜方面存在积极的影响，值得进一步研究并进行推广。

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Screening, Preliminary Application and Biocontrol

摘要

Abstract

目 录

第一章 绪 论

水蜜桃的概述

1.1.1 水蜜桃简介

1.1.2 主要产地及生产现状

水蜜桃采后病害的主要防治方法

化学方法

物理方法

生物方法

拮抗酵母菌概述

拮抗酵母菌的优势

1.3.2 拮抗酵母的作用机制

1.3.3 生防系统

1.3.4 拮抗酵母抑菌效果的优化

1.4 生防制剂

1.4.1 固体制剂

1.4.2 液体制剂

1.5本课题研究的目的、意义及内容

第二章 拮抗酵母菌的分离、筛选及鉴定

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 仪器与设备

2.2.2 培养基

2.2.3 供试材料

2.2.4 病原菌及其孢子悬浮液制备

2.2.5 拮抗酵母菌的分离

2.2.6 拮抗酵母菌的筛选

2.2.7.1 细胞形态学观察

2.2.8 拮抗酵母的鉴定

2.2.9 数据统计与分析

2.3 结果与讨论

2.3.1分离与筛选的拮抗酵母菌

2.3.2 拮抗酵母菌的形态学特征

2.3.3 拮抗酵母菌的分子鉴定

2.4 本章小结

第三章 K. apiculata Y23抑制水蜜桃采后炭疽病机理的研究

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 仪器与设备

3.2.2 培养基

3.2.3 供试材料

3.2.4 病原菌及其孢子悬浮液制备

3.2.5 K. apiculata Y23抑制水蜜桃采后炭疽病最佳浓度的确定

3.2.6 K. apiculata Y23对C. gloeosporioides孢子萌发的影响

3.2.7 K. apiculata Y23寄生作用的观察

3.2.8 平板对峙培养研究K. apiculata Y23的抑菌效果

3.2.9 倒扣实验研究K. apiculata Y23的抑菌效果

3.2.10 K. apiculata Y23对水蜜桃防卫反应的影响

3.2.11 数据统计与分析

3.3 结果与讨论

3.3.1 K. apiculata Y23抑制水蜜桃采后炭疽病最佳浓度

3.3.2 K. apiculata Y23对C. gloeosporioides孢子萌发的影响

3.3.3 K. apiculata Y23的寄生作用

3.3.4 平板对峙培养时K. apiculata Y23的抑菌效果

3.3.5 倒扣实验时K. apiculata Y23的抑菌效果

3.3.6 K. apiculata Y23影响水蜜桃的防卫反应

3.4 本章小结

第四章 K. apiculata Y23抑制纤维素酶活性的初步探究

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1仪器与设备

4.2.2 培养基

4.2.3 供试材料

4.2.4 病原菌

4.2.5 C. gloeosporioides产纤维素酶的观察

4.2.6 K. apiculata Y23对纤维素酶活性的抑制效果

4.2.7 K. apiculata Y23抑制纤维素酶活性的机理探究

4.3 结果与讨论

4.3.1 C. gloeosporioides产纤维素酶的观察

4.3.2 K. apiculata Y23抑制纤维素酶活性的结果

4.3.3 K. apiculata Y23抑制纤维素酶活性的机理探究结果

4.4 本章小结

第五章 K. apiculata Y23活性冻干粉的制备

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 仪器与设备

5.2.2 培养基

5.2.3 K. apiculata Y23离心参数的选择

5.2.4 单一保护剂的筛选

5.2.5复合保护剂的正交优化

5.2.6 K. apiculata Y23活性冻干粉贮藏期间存活率的变化

5.2.7 数据统计与分析

5.3 结果与讨论

5.3.1 K. apiculata Y23的离心参数

5.3.2 单一保护剂的筛选

5.3.3 复合保护剂的筛选

5.3.4 K. apiculata Y23存活率在储藏期的变化

5.4 本章小结

第六章 Y23活性冻干粉对贮藏期间水蜜桃品质的影响

6.1 前言

6.2 材料与方法

6.2.1 仪器与设备

6.2.2 培养基

6.2.3 供试材料

6.2.4 K. apiculata Y23活性冻干粉对水蜜桃的不同处理

6.2.5 测定K. apiculata Y23在水蜜桃表皮的生长动态

6.2.6 贮藏期间水蜜桃腐烂指数的测定

6.2.7 贮藏期间水蜜桃失重率的测定

6.2.8 贮藏期间水蜜桃果实硬度的测定

6.2.9 贮藏期间水蜜桃可溶性固形物含量的测定

6.2.10 贮藏期间水蜜桃果皮细胞膜透性的测定

6.2.11 贮藏期间水蜜桃抗坏血酸含量的测定

6.2.12 贮藏期间水蜜桃总酸含量的测定

6.2.13 数据统计与分析

6.3 结果与讨论

6.3.1 K. apiculata Y23在水蜜桃表皮的生长动态

6.3.2 贮藏期间水蜜桃腐烂指数的变化

6.3.3 贮藏期间水蜜桃失重率的变化

6.3.4 贮藏期间水蜜桃果实硬度的变化

6.3.5 贮藏期间水蜜桃可溶性固形物含量的变化

6.3.6 贮藏期间水蜜桃果皮细胞膜透性的变化

6.3.7 贮藏期间水蜜桃维生素C含量的变化

6.3.8 贮藏期间水蜜桃总酸含量的变化

6.4 本章小结

第七章 结论与展望

7.1 结论

7.2 展望

参考文献

攻读硕士期间发表的论文和参加的科研