微波加热对微生物的亚细胞结构影响和死亡规律的研究

摘要

微波作为一种新型的加热技术，广泛用于食品的解冻、干燥、焙烤、灭酶以及杀菌等。与传统热力杀菌相比，微波杀菌具有加热时间短、升温速度快、加热更均匀、对热敏性营养成分和风味物质破坏少等优点，已成为国内外食品科学与工程领域研究热点之一。尽管微波杀菌方面的研究报道较多，但是关于微波杀菌的机理还不是很透彻。微波与生物体的相互作用是一个极其复杂的过程。目前，微波产生的热效应作为其杀菌机理的解释为人们广泛接受，但微波杀菌过程中所表现出来的一些异常现象是热效应所无法解释的，很多学者认为微波杀菌可能还存在着非热效应(即生物学效应)，但至今尚无定论。 为了进一步探讨微波杀菌的机理，本文选取食品中常见的、同时也是典型的有害微生物一大肠杆菌(Escherichia coli，G<'->)与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，G<'+>)作为研究对象，利用程序控制模拟水浴升温比较微波和水浴杀菌D值和z值，从宏观角度考察微波的非热效应；利用荧光分析等方法从细胞膜通透性、蛋白质与核酸变性、代谢酶活变化等方面，深入亚细胞结构和分子水平研究微波处理对微生物细胞的影响，以期探寻一些可以进一步揭示微波杀菌机理的有力证据。 大肠杆菌(Escherichia coli，G<'->)与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，G<'+>)在微波场中的致死规律研究表明，这两种菌的致死率随温度变化的曲线基本上都呈倒“S”型，但死亡情形明显不同。大肠杆菌在55℃～65℃较窄的一段温度范围内致死率迅速上升，在65℃以后基本保持不变，且在温升时间内不能达到100％的致死率；而金黄色葡萄球菌的致死率随温度上升而逐渐增加，但与大肠杆菌相比，在同样的温升时间内可以表现出更高的致死率，且能够达到100％的杀灭，说明金黄色葡萄球菌对微波更为敏感，有可能存在非热效应。进一步考察微波功率、pH值和NaCl浓度对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的致死率影响，发现功率对致死率的影响不显著，pH值显著影响微波的杀菌效果，而高浓度NaCl溶液会降低微波杀菌的效果，这可能是高浓度NaCl会影响微波加热的均匀性。 微生物细胞膜受损后可能会表现出通透性的增加，利用Fluo-3/AM作为Ca<'2+>荧光探针，可以精确检测微波处理前后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞内Ca<'2+>浓度的变化。通过荧光分析方法研究微波处理前后细胞膜通透性的变化，结果表明经微波处理后E.coli和S.aureus胞内Fluo-3的荧光强度随处理温度的升高而增强，说明微波处理导致细胞膜通透性的增加，且大肠杆菌表现得更为明显。 蛋白质分子具有“内源荧光”，蛋白质、核酸的变性会使得荧光生色团充分地暴露出来。荧光实验表明，微波处理后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌体蛋白质与核酸的变性程度随处理温度升高而增加，两者情形大致相同。 利用氯化碘硝基四氮唑紫(INT)和二乙酸荧光素(FDA)生物染料分别定量地测定经微波处理后活细胞内电子传递链的脱氢酶和非特异性酯酶的活性。大肠杆菌中的电子传递链的脱氢酶(ETC-DHs)和非特异性酯酶(NSE)在不同微波处理温度时，ETC-DHs的酶活先升高随后降低，在55℃有最大值，NSE的酶活在60℃达到最大值，随后呈下降趋势；金黄色葡萄球菌中的非特异性酯酶(NSE)和电子传递链中脱氢酶(ETC-DHs)均随温度的升高呈迅速下降趋势，特别是非特异性酯酶在超过60℃后酶活已经降到非常低的水平，这也可能是金黄色葡萄球菌比大肠杆菌表现出对微波更为敏感的原因之一。利用程序模拟水浴升温曲线，可以在几乎相近的条件下测定微波加热与水浴杀菌的D值和z值，比较微波与水浴加热的杀菌效果，试图从宏观角度观察微波的生物学效应。但实验结果表明，在相同的升温曲线下微波与水浴杀菌的D值和Z值没有显著差异。说明在此实验条件下，还不足以观察到微波杀菌的非热效应。 通过本实验研究，可以发现不同微生物在微波场中的死亡规律有所不同，金黄色葡萄球菌比大肠杆菌具有更高的致死率，表现出一定的非热效应；微波处理对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌胞内电子传递链中的脱氢酶和非特异性酯酶活性的影响显著不同，说明微波对酶活影响具有双重效应；非热效应主要体现在微观水平上，而热效应主要体现在宏观水平上。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1微波加热的原理及特点

1.2微波杀菌技术在食品中的应用

1.2.1在植物食品杀菌中的应用

1.2.2在肉制品杀菌中的应用

1.2.3在乳制品杀菌中的应用

1.2.4在多组分食品杀菌中的应用

1.3微波杀菌工艺的研究与应用

1.3.1连续式微波杀菌工艺的研究与应用

1.3.2脉冲微波杀菌技术研究发展

1.3.3多次快速加热和冷却的微波杀菌工艺

1.4微波杀菌的机理与非热效应

1.4.1微波杀菌的热效应

1.4.2微波杀菌的非热效应

1.4.3微波杀菌非热效应的理论解释

1.4.4非热效应研究的手段和模型

1.5本研究的主要内容和重要意义

1.5.1本研究的重要意义

1.5.2主要研究内容

第二章微波杀菌的致死规律及影响因素

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1菌种

2.2.2试剂与药品

2.2.3实验仪器与设备

2.2.4实验方法

2.3实验结果与讨论

2.3.1菌悬液微波加热的温升特点

2.3.2大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的致死规律

2.3.3微波功率对杀菌效果的影响

2.3.4 pH值对杀菌效果的影响

2.3.5 NaCl浓度对杀菌效果的影响

2.4本章小结

第三章微波杀菌过程中细胞膜通透性的变化

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1菌种

3.2.2试剂与药品

3.2.3实验仪器与设备

3.2.4实验方法

3.3结果与讨论

3.3.1微波加热对大肠杆菌细胞膜通透性的影响

3.3.2微波加热对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响

3.3.3细胞膜通透性与微生物细胞存活的关系

3.4本章小结

第四章微波杀菌过程中蛋白质、核酸的变性以及呼吸链中脱氢酶、非特异性酯酶活性的变化

4.1前言

4.2材料与方法

4.2.1菌种

4.2.2试剂与药品

4.2.3实验仪器与设备

4.2.4实验方法

4.3结果与讨论

4.3.1微波处理后胞内蛋白质、核酸的变性

4.3.2微波处理后呼吸链中的脱氢酶活性的变化

4.3.3微波处理后胞内非特异性酯酶活性变化

4.4本章小结

第五章程序模拟升温比较水浴和微波加热杀菌的D值和Z值

5.1前言

5.2材料与方法

5.2.1菌种

5.2.2试剂与药品

5.2.3实验仪器与设备

5.2.4实验方法

5.3结果与分析

5.3.1连续微波加热与水浴加热升温曲线比较

5.3.2程序控制以后菌液的温度变化

5.3.3大肠杆菌、和金黄色葡萄球菌D值的比较

5.3.4大肠杆菌与金黄色葡萄球菌Z值的比较

5.4本章小结

主要结论

致 谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文清单