土豆羧肽酶抑制剂编码基因的克隆与表达

摘要

土豆羧肽酶抑制剂(carboxypeptidaseInhibitorfromPotatoes，CPI)是一种由39个氨基酸残基组成的球状多肽，近年来的研究发现其极有可能成为理想的辅助溶栓药物，以克服目前临床溶栓药物使用过程中安全剂量过窄、容易引起出血等缺陷。人血浆羧肽酶B原(carboxypeptidaseB，CPB)也称凝血酶活化的纤溶抑制剂(thrombin-activatablefibrinolysisinhibitor,TAFI)，经激活后形成的TAFIa能抑制纤溶酶原生成纤溶酶，从而抑制纤溶系统的启动，阻碍溶栓。CPI即通过对TAFIa的特异性抑制，而达到了治疗溶栓的目的。目前获得土豆羧肽酶抑制剂主要从土豆中提取得到，分离繁琐，得率较低，来自土豆的有毒物质龙葵素难以完全除去。也有报道通过人工合成cpi基因构建分泌表达质粒并在E.coli中成功表达具有生物活性的重组CPI(reCPI)，但从培养液中分离纯化reCPI步骤多，收率低。本文研究了通过在大肠杆菌中融合表达而制备reCPI的新方法。 利用PCR技术扩增得到CPI的编码基因，克隆于表达载体pGEX-4T-1的多克隆位点中，得到重组质粒pGCPI，测序后将重组质粒转化到受体菌EscherichiacoliBL21中进行表达。经37℃培养2h，在0.2mmol/L的IPTG存在下，于37℃诱导4h，重组E.coliBL21(pGCPI)可合成约占菌体总蛋白22.6％的可溶性reCPI-GST融合蛋白。 通过在摇瓶条件下的优化，得到最佳培养和表达条件为：LB培养基中，接种量为5％，经37℃培养至A600为0.5-0.7时添加终浓度为0.2mmol/L的IPTG，在30℃持续诱导5小时进行表达。通过单因素优化实验，得到经济适用、易于扩大培养重组菌的培养基配方：葡萄糖10g/L，硫酸铵1g/L，蛋白胨3g/L，柠檬酸2g/L，磷酸二氢钾15g/L，MgSO4·7H2O1.5g/L，TES5mL/L；pH为7.0。在3.7L台式搅拌发酵罐中，控制溶氧在30％以上，重组菌的对数生长中期流加碳源和氮源，最终菌体光密度A600达到52.4，菌体干重为26.2g/L，目的蛋白的表达量达到24.8％。 利用谷胱甘肽SepharoseFF亲和层析、凝血酶切割、谷胱甘肽SepharoseFF亲和层析、超滤这四步简易而方便的操作，成功地将短肽reCPI分离纯化出来。通过该方法，可以从500mL发酵液中提取出reCPI698μg，纯度为98.9％，得率达60.5％。通过测定reCPI的生物学功能，发现其抑制CPA的活性和促进纤溶的生物功能与天然CPI无明显差别。

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第一章绪论

第二章土豆羧肽酶抑制剂编码基因cpi的克隆与表达

第三章重组菌E. coli BL21(pGCPI)的培养与表达

第四章重组土豆羧肽酶抑制剂reCPI的纯化及活性鉴定

第五章结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间所发表的论文

附录中文名称与英文缩写对照