猪喉软骨硫酸软骨素的制备和抗氧化、降血脂机理研究

摘要

硫酸软骨素(ChS)是来源于动物的一类重要的糖胺聚糖，具有抗炎、抗癌、降血脂和抗氧化等功能。以往主要是通过氢氧化钠-胰酶复合工艺来制备。本试验选择木瓜蛋白酶单酶酶解工艺来提取ChS，对其进行分离纯化和结构分析，研究ChS体外抗氧化特性，并以高脂日粮大鼠为试验动物，研究其抗氧化和降血脂机理。 分别用木瓜蛋白酶和氢氧化钠-胰酶酶解工艺提取ChS，用三氯乙酸、DEAE-SepharoseFast Flow离子交换柱层析和Sephacryl S-300 HR凝胶柱层析进行分离纯化。初步比较了两种方法提取的ChS的基本特征。结果显示木瓜蛋白酶提取的ChS产品色泽洁白，平均相对分子质量43569，分布系数为2.04，工艺简单，提取率30.51±0.89％，重复性好，传统工艺氢氧化钠-胰酶提取的ChS产品色泽深，平均相对分子质量25773，分布系数为3.15，工艺复杂，提取时间长，提取率21.23±1.65％。通过单因素实验和正交实验，确定了木瓜蛋白酶提取ChS的最佳工艺：温度60℃，pH值6.0，木瓜蛋白酶浓度为0.7％，提取时间7 h。DEAE-Sepharose Fast．Flow离子交换柱层析和Sephacryl S-300 HR分离纯化的ChS经琼脂糖凝胶电泳和高效凝胶排阻柱色谱鉴定为高纯度的均一性大分子。 采用脂质体过氧化体系、比色法和化学发光法研究ChS的体外抗氧化作用。结果显示两种方式提取的ChS对超氧阴离子自由基(O<,2><'->)和羟基自由基(-OH)具有明显的清除作用，其中木瓜蛋白酶提取ChS的O<,2><'->·和·OH清除效果好于氢氧化钠．胰酶提取ChS，对于O<,2><'->，两者的半数抑制浓度(IC<,50>)分别为(0.9±0.09)和(2.9±0.11)mg·mL<'-1>(p<0.01)，对于·OH，两者的IC<,50>分别为(8.92±0.09)和(9.08±0.06)mg·mL<'-1> (p<0.01)。两种方式提取的ChS对DPPH自由基、过氧化氢和脂质体过氧化体系都没有显著作用。 接着将ChS进行羧基还原、脱硫和多硫酸化化学修饰，初步探讨ChS是否与铜离子、发生配合作用、是否与O<,2><'-1>之间发生相互作用，同时利用生物化学发光、平衡透析、荧光分析、红外光谱和热分析等技术探讨ChS修饰前后的体外·OH和O<,2><'->清除特性，探讨发生反应的可能基团。结果显示ChS经碳二亚胺和氯磺酸分别还原和多硫酸化后，都没有显示出·OH清除活性，未经修饰的ChS和脱硫后的ChS清除．OH的IC<,50>分别为(8.90±0.16)mg·mL<'-1>和(5.65±0.31)mg·mL<'-1>。ChS在去离子水中具有铜离子配合作用，在酸性介质中配合作用消失，在一定浓度范围内，ChS对Cu<'2+>的配合作用随浓度的升高而升高，脱硫后的ChS对Cu<'2+>的配合作用极显著高于未经修饰的ChS，但是经羧基还原和多硫酸化后的ChS对Cu<'2+>的配合作用都极显著低于未经修饰的ChS。ChS与铜形成配合物后，光谱学特征和热稳定性明显改变，乙酰基的红外特征吸收频率在反应前后未改变，说明其没有参与配位反应，而羧基相反，结合荧光淬灭实验，初步认为是羧基而不是硫酸基与Cu<'2+>发生配合作用，阻断·OH的产生；脱硫和还原后的ChS对O<,2><'->·清除活性极显著低于未经修饰的ChS，硫酸酯化后的ChS产品的O<,2><'->·清除活性强于未经过修饰的ChS，但差异不显著(p>0.05)。ChS与O<,2><'->·反应后，红外分析显示归属于羧基和硫酸基伸缩振动的吸收峰(1418.21 cm<'-1>和1230 cm<'-1>)明显减弱，硫酸基轴向振动吸收峰(855 cm<'-1>)消失，并且出现两个新的吸收峰(1451.52 cm<'-1>和869.48 cm<'-1>)；ChS与O<,2><'->·反应后，热稳定性明显改变，ChS在244.95℃-250.166℃发生分解，为放热反应。反应后ChS放热峰消失，在122.483℃-128.76℃和172.10℃-199.36℃范围出现两个吸热峰，证实了ChS的羧基和硫酸基确实与O<,2><'->·发生了化学反应。 采用灌胃法探讨ChS对高脂日粮大鼠的抗氧化作用。24只大鼠适应环境后，根据空腹称重随机分为正常对照组(NC，正常饲料)，高脂模型组(HFD，高脂饲料)，ChS添加组1(Res 1，500 mg·kg<'-1>·d<'-1>)和ChS添加组2(Res 2，1000 mg·kg<'-1>·d<'-1>)，连续灌胃5周后测定血清和肝脏中MDA、T-AOC、SOD、GSH、CAT、CP、MPO活性、·OH抑制能方和线粒体DNA氧化损伤程度。结果显示：尽管高剂量组ChS没有比低剂量组ChS有更明显的抗氧化作用，但两组ChS组都能显著升高T-AOC和降低MDA含量，降低高脂日粮大鼠氧化应激；显著升高高脂日粮大鼠血清和组织中的内源性抗氧化剂SOD、GSH、CAT和CP的活性；增强血清和肝脏的羟基自由基抑制能力；降低MPO活性和减轻线粒体的氧化损伤。恢复机体的氧化还原系统的动态平衡，减少自由基的毒副作用，降低蛋白质和核酸等生物大分子的氧化损伤。 ChS对高脂日粮大鼠的降血脂作用结果显示ChS显著降低高脂日粮大鼠血清和肝脏TC、TG含量，并随着剂量的增加而增加；升高血清和肝脏LPL和HL活性；显著降低血清LDL-C含量；降低动脉粥样硬化指数。低剂量ChS可显著升高HDL-C含量，高剂量ChS却相反，并且该组血清TC和TG含量显著低于正常组。说明ChS过多也可能进一步导致血脂代谢紊乱。 比色法、HPLC和GC证明ChS主要含葡萄糖醛酸、乙酰氨基半乳糖、木糖和半乳糖组成，摩尔比分别为：32.92:32.14:1:1.39。红外光谱分析表明ChS中含有6-硫酸化乙酰氨基半乳糖和4-硫酸化乙酰氨基半乳糖，结合ChS的ChS酶ABC裂解产物的琼脂、糖凝胶电泳和HPLC分析，表明ChS为均一大分子，不含有其它硫酸角质类糖胺聚糖分子。由比色法、HPLC、LC-MS、NMR(<'1>H NMR、<'13>C NMR、DEPT90、DEPT 135、H-H COSY和NOESY)谱进一步推测猪喉软骨ChS包含GIcA(β1-3)GalNAc4SO<,3>、GlcA(β1-3)GaINAc6SO<,3>重复结构单元，不存在GlcA2SO<,3>(β1-3)GalNAc4SO<,3>、GlcA2SO<,3>(β1-3)GaINAc6SO<,3>(DS特征)和NeuAc(α2-3)Gal(β1-4)GIcNAc4SO<,3>(KS特征)重复结构单元。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章 绪 论

1.1糖胺聚糖研究概述

1.2硫酸软骨素研究概述

1.3硫酸软骨素的提取

1.3.1非降解提取法

1.3.2碱提取法

1.3.3酶提取法

1.3.4碱-酶提取法

1.4硫酸软骨素的分级分离

1.4.1沉淀法

1.4.2柱色谱法

1.4.3其它

1.5分析方法

1.5.1硫酸软骨素的一般测定方法

1.5.2硫酸软骨素结构测定

1.6硫酸软骨素的生物活性

1.6.1调整体内水分

1.6.2免疫调节作用

1.6.3调节关节机能，抗关节炎作用

1.6.4抗氧化作用

1.6.5缓和的抗凝血活性

1.6.6调节细胞黏附作用

1.6.7神经元的保护和修复作用

1.7立题背景和主要研究内容

1.7.1立题背景和意义

1.7.2主要研究内容

参考文献

第二章硫酸软骨素的提取分离和纯化

2.1前言

2.2材料和方法

2.2.1实验材料

2.2.2主要仪器

2.2.3硫酸软骨素的提取

2.2.4离子交换柱层析

2.2.5 Sephacryl S-300 HR凝胶柱层析

2.2.6硫酸软骨素纯度鉴定

2.2.7各指标的测定

2.3结果与分析

2.3.1粗多糖得率及糖醛酸含量分析

2.3.2猪喉软骨硫酸软骨素的纯化

2.3.3 ChS主要成分分析

2.3.4 ChS的氨基酸分析

2.3.5硫酸软骨素的纯度鉴定及分子量分布

2.3.6木瓜蛋白酶提取ChS条件的优化

2.4讨论

2.5本章小结

参考文献

第三章硫酸软骨素的体外抗氧化作用

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1主要试剂

3.2.2硫酸软骨素抗脂质体过氧化实验

3.2.3 DPPH·清除实验

3.2.4羟基自由基清除试验

3.2.5超氧阴离子自由基清除试验

3.2.6过氧化氢清除实验

3.3结果和分析

3.3.1硫酸软骨素DPPH·清除作用

3.3.2硫酸软骨素·OH和O2-·清除作用

3.3.3软骨各多糖级分对·OH和O2-·清除作用

3.4 讨论

3.5本章小结

参考文献

第四章硫酸软骨素体外自由基清除作用机理初步探讨

4.1前言

4.2材料与方法

4.2.1主要试剂

4.2.2还原性硫酸软骨素(EDC-ChS)的制备

4.2.3 ChS多硫酸酯(Sulfated-ChS)的制备

4.2.4 ChS的脱硫反应

4.2.5硫酸软骨素及衍生物的自由基清除活性

4.2.6硫酸软骨素及衍生物与铜的配位作用

4.2.7硫酸软骨素与O2-·反应前后的红外光谱分析

4.2.8硫酸软骨素与O2-·反应前后的热分析

4.2.9硫酸软骨素铜配合物的制备及光谱学和热分析

4.2.10指标测定

4.2.11统计分析

4.3结果、分析和讨论

4.3.1硫酸软骨素及衍生物的红外光谱表征

4.3.2硫酸软骨素及衍生物的自由基清除活性

4.3.3硫酸软骨素及衍生物与铜离子的配位特性

4.3.4硫酸软骨素与O2-·反应前后的红外光谱分析

4.3.5硫酸软骨素与O2-·反应前后的热分析

4.3.6硫酸软骨素铜配合物的物理性质变化

4.3.7讨论

4.4本章小结

参考文献

第五章硫酸软骨素对高脂日粮大鼠的抗氧化作用机理研究

5.1前言

5.2材料与方法

5.2.1实验动物

5.2.2药品与实验材料

5.2.3主要仪器

5.2.4实验设计与饲料配方

5.2.5检测指标与方法

5.2.6统计学处理

5.3结果与分析

5.3.1 ChS对血清和肝脏T-AOC、MDA的影响

5.3.2 ChS对血糖浓度的影响

5.3.3 ChS对血清SOD、GSH、CP和CAT活性的影响

5.3.4 ChS对肝脏SOD、GSH、CP和CAT活性的影响

5.3.5 ChS对血清和肝脏MPO的影响

5.3.6 ChS对血清和肝脏羟基自由基抑制能力的影响

5.3.7 ChS对肝脏线粒体氧化损伤的影响

5.4讨论

5.4.1 ChS对高脂日粮大鼠脂质过氧化水平的影响

5.4.2 ChS对高脂日粮大鼠的内源抗氧化剂的影响

5.4.3 ChS对高脂日粮大鼠肝脏线粒体DNA氧化损伤的影响

5.4.4 ChS对对高脂日粮大鼠血清和肝脏MPO的影响

5.4.5 ChS对对高脂日粮大鼠血清和肝脏羟基自由基抑制能力的影响

5.5本章小结

参考文献

附图

第六章硫酸软骨素降低高脂日粮大鼠血脂机理研究

6.1前言

6.2材料与方法

6.2.1实验动物

6.2.2药品与实验材料

6.2.3主要仪器

6.2.4实验设计与饲料配方

6.2.5检测指标与方法

6.2.6统计学处理

6.3结果与分析

6.3.1 ChS对高脂日粮大鼠体重的影响

6.3.2 ChS对高脂日粮大鼠血清脂质的影响

6.3.3 ChS对高脂日粮大鼠血清和肝脏LPL、HL的影响

6.3.4 ChS对高脂日粮大鼠HDL-C/TC、HDL-C/LDL-C比值和AI的影响

6.3.5 ChS对高脂日粮大鼠酸性糖胺聚糖的影响

6.3.6 ChS对高脂日粮大鼠肝脏形态的的影响

6.4讨论

6.4.1 ChS对高脂日粮大鼠的血脂调节作用

6.4.2 ChS对高脂日粮大鼠LPL和HL的调节作用

6.5本章小结

参考文献

附图

第七章猪喉软骨硫酸软骨素结构分析

7.1前言

7.2材料和方法

7.2.1实验材料

7.2.2主要仪器

7.3硫酸软骨素的组成成分分析

7.3.1己糖醛酸的鉴别和定量

7.3.2氨基己糖的鉴别和定量

7.3.3气相色谱测定硫酸软骨素的中性单糖组成

7.3.4硫酸根连接类型的初步确定

7.3.5紫外扫描和红外光谱(IR)测定

7.3.6硫酸软骨素糖苷键的初步判断

7.3.7硫酸软骨素的酶解分析

7.3.8 NMR分析

7.4结果与分析

7.4.1硫酸软骨素糖醛酸的鉴别和定量

7.4.2硫酸软骨素的氨基己糖的鉴别和定量

7.4.3硫酸软骨素中性糖的鉴别和定量

7.4.4硫酸软骨素硫酸根连接位置的判断

7.4.5硫酸软骨素紫外光谱分析

7.4.6硫酸软骨素红外光谱分析

7.4.7硫酸软骨素糖肽键类型分析

7.4.8硫酸软骨素的酶解分析

7.4.9 ChS的NMR分析

7.5本章小结

参考文献

论文主要结论

论文创新点

攻读博士学位期间发表的学术论文

致谢