植物乳杆菌ST-Ⅲ对肠上皮细胞的粘附性质及机理的研究

摘要

益生菌对胃肠道粘膜的粘附能力是发挥益生作用的前提条件，粘附的益生菌能够抑制病原菌的入侵，调节消化道内菌群的平衡，因此粘附能力是益生菌筛选的重要标准之一。研究益生菌的粘附性质及机理有助于阐明益生菌对胃肠道微环境的改善以及病原菌的生态防治。本文以干酪乳杆菌BD-II、植物乳杆菌ST-III和干酪乳杆菌LC2W三株具有良好益生功能的乳酸菌为研究对象，以人肠上皮样细胞Caco-2为模型，筛选出粘附性能较好的菌株，就其粘附性质、对致病菌粘附的抑制作用及相关机理进行初步的研究。 首先，选取具有良好粘附性能的LGG作为阳性对照，研究三株益生菌株的粘附性能和表面性质，初步探讨与肠细胞的粘附机理。结果发现ST-III是所测试的四株菌中粘附能力最强的。当加入细菌浓度为5.0×100CFU/mL(细菌和细胞之比约为300：1)，平均每个Caco-2细胞上的粘附数为28.43CFU/细胞。在粘附与表面性质相关性实验中，所测试的四株菌的粘附能力和疏水性具有很好的相关性，表明可能主要是疏水作用参与了所测试菌株与Caco-2细胞的粘附。糖类抑制试验和酵母凝集试验表明ST-III菌体表面分布着甘露糖特异性凝集素。选择粘附性能最好的ST-Ill作为研究对象，研究了动力学因素和外在环境因素对其粘附效果的影响。结果发现ST-III对Caco-2细胞的粘附是多种因素共同作用的结果，它们的主要作用方式是通过影响粘附素与受体的结合。以上结果表明，ST-III对Caco-2细胞的粘附可能涉及到非特异性的疏水结合和甘露糖特异性粘附两个过程，粘附素与受体的特异性结合占主导地位。 其次，以LGG作为对照，采用CFDA-SE荧光标记的方法研究了ST-III对致病性大肠杆菌和肠炎沙门氏菌粘附Caco-2细胞的排除、竞争和替代作用，并通过检测细胞膜的通透性分析益生菌对Caco-2细胞的保护作用。结果发现ST-III对致病菌粘附的抑制作用存在量效关系。在三种作用方式中，ST-III对致病菌的排除作用最强，竞争作用其次，而替代作用最弱，表明提前加入ST-III能更有效地减少致病菌的粘附和侵入；细胞膜通透性结果表明ST-III在与致病菌共同作用于肠细胞时，能通过竞争性占位效应，使宿主细胞免受损伤。 最后，通过化学和酶处理ST-III细胞壁表面成分、提取相关物质，对ST-III的粘附素和对致病菌粘附的抑制机理进行了研究。结果表明ST-III菌体的表面蛋白参与了其与Caco-2细胞的粘附，其主要成分为分子量在21-70kDa的三组蛋白；ST-III对大肠杆菌与Caco-2细胞粘附的抑制作用主要是由于其表面蛋白与Caco-2细胞上的甘露糖受体相结合阻止了大肠杆菌的结合，而对沙门氏菌粘附的抑制作用主要是通过空间位阻形成的。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1肠道菌群及其作用

1.1.1肠道菌群

1.1.2肠道菌群的分类

1.1.3调整肠道菌群失调的措施

1.2益生菌的粘附性质

1.2.1益生菌及粘附性质简介

1.2.2体外细胞模型

1.2.3细菌粘附实验方法的研究进展

1.2.4影响乳酸菌粘附的因素

1.3乳酸菌的粘附机理

1.3.1粘附与表面性质的关系

1.3.2粘附素的研究概况

1.3.3表面蛋白

1.4乳酸菌对肠道致病菌粘附的抑制作用

1.5本研究的主要内容和重要意义

1.5.1本研究的重要意义

1.5.2主要研究内容

第二章植物乳杆菌ST-Ⅲ粘附性质的研究

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1菌种和细胞

2.2.2试剂与药品

2.2.3试验仪器与设备

2.2.4微生物培养

2.2.5细胞培养

2.2.6乳杆菌菌悬液的制备

2.2.7乳杆菌对Caco-2细胞的粘附试验

2.2.8细菌表面性质的测定

2.2.9酵母凝集度的测定

2.2.10 ST-Ⅲ对细胞粘附作用的动力学研究

2.2.11外部因素对ST-Ⅲ粘附作用影响

2.2.12数据分析

2.3结果

2.3.1乳杆菌对Caco-12细胞粘附性能的比较

2.3.2不同乳杆菌表面性质的比较

2.3.3乳杆菌对酵母的凝集性

2.3.4 ST-Ⅲ对Caco-2细胞粘附作用的动力学研究

2.3.5外部因素对ST-Ⅲ粘附Caco-2细胞的影响

2.4讨论

2.5本章小结

第三章ST-Ⅲ对肠道致病菌的粘附抑制及对肠细胞保护作用的研究

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1菌种和细胞

3.2.2试剂与药品

3.2.3试验仪器与设备

3.2.4微生物培养

3.2.5细胞培养

3.2.6细菌菌悬液的制备

3.2.7致病菌荧光标记

3.2.8粘附抑制实验

3.2.9细胞膜通透性的检测

3.3结果

3.3.1荧光标记结果

3.3.2粘附抑制试验

3.3.3细胞膜通透性的检测

3.4讨论

3.5本章小结

第四章ST-Ⅲ粘附及对致病菌粘附抑制机理的研究

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1菌种和细胞

4.2.2试剂与药品

4.2.3试验仪器与设备

4.2.4微生物培养、细胞培养及细菌菌悬液的制备

4.2.5细菌的荧光标记

4.2.6粘附试验

4.2.7化学和酶处理对粘附的影响

4.2.8表面蛋白粗品的提取

4.2.9表面蛋白粗品性质的测定

4.2.10磷壁酸的提取

4.2.11粘附抑制试验

4.2.12表面蛋白可逆性结合细胞壁的验证

4.2.13表面蛋白的体外抑菌情况测定

4.3结果

4.3.1荧光标记结果和粘附测定方法的相关性分析

4.3.2化学和酶处理对粘附的影响

5.3.3表面蛋白性质的测定

4.3.4粘附抑制实验

4.3.5表面蛋白可逆性结合细胞壁的验证结果

4.3.6粘附素对致病菌粘附的抑制结果

4.3.7表面蛋白的体外抑菌情况测定

4.4讨论

4.5本章小结

主要结论

问题与展望

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文清单