絮凝性酿酒酵母基因工程菌的构建与发酵

摘要

本研究的目的是采用遗传改良技术，使酿酒酵母絮凝基因FLO1在发酵性能优良的工业酿酒酵母中表达，得到絮凝重组工业酿酒酵母菌株，以利于在酒精发酵末期利用酵母自身的絮凝沉降能力从醪液中分离细胞，节约酒精生产的能源成本。研究内容如下：把酿酒酵母絮凝基因FLO1接入表达载体pYX212，构建重组质粒pYX-FLO并转化酿酒酵母W303-1A，得到絮凝重组酿酒酵母W303-1AF4；在质粒pYX-FLo中接入筛选标记G418抗性基因kanMX表达盒，构建重组质粒pYX-FLO-kan转化工业酿酒酵母ZWA46，得到絮凝重组工业酿酒酵母ZWA46-F2；利用絮凝重组菌ZWA46-F2进行细胞回用反复分批发酵及连续发酵等生产酒精的工艺研究；以及对絮凝基因FLO1编码产物酵母胞壁蛋白Flo1p进行研究。主要研究结果如下： 1.重组酿酒酵母W303-1AF4的絮凝值达到70％且絮凝能力传代稳定；在培养基初始pH2.5-7.0范围内，重组菌W303-1AF4絮凝能力变化不大；重组菌W303-1AF4在细胞生长稳定期前期启动絮凝，其絮凝的启动和葡萄糖耗竭非耦联。实验结果证明可以通过启动子TPI控制絮凝基因FLO1表达的遗传操作方法获得絮凝重组酿酒酵母W303-1AF4，为基因FLO1在工业酿酒酵母中的表达奠定了研究基础。 2.工业酿酒酵母絮凝基因工程菌Ay-F12的絮凝值达到80％而且具有良好的传代稳定性能。在初始pH3.5-5.5范围内，其絮凝性能没有明显变化，但对其酒精生产能力有较大的影响。重组菌Ay-F12在细胞生长稳定期前期启动絮凝，其絮凝的启动和葡萄糖耗竭呈非耦联关系。5L发酵罐实验表明，重组菌Ay-F12和野生菌Angelyeast的发酵过程变化规律基本一致，但前者较后者的发酵周期稍有延迟(6h)。重组菌Ay-F12的酒精产量最高达到8.1％(v/v)，酒精对葡萄糖的转化率达到其理论转化率的84.5％。 3.重组菌Ay-F12在30至40℃的温度条件下，能保持较好的酒精发酵能力。在30-50℃温度范围内，菌体细胞的絮凝能力基本一致。重组菌Ay-F12在较高温度条件下，既能保持较好的酒精发酵性能，又具有良好的絮凝能力。 4.絮凝重组工业酿酒酵母ZWA46-F2的絮凝能力达到95％且絮凝传代稳定；在培养基初始pH2.5-6.0范围内，重组菌ZWA46-F2的絮凝性能没有明显变化，但对其酒精生产能力有较大的影响；重组菌ZWA46-F2在细胞生长稳定期前期启动絮凝，其絮凝的启动和葡萄糖耗竭呈非耦联关系；在30-50℃温度范围内，菌体细胞的絮凝能力基本一致。 5.5L发酵罐实验表明，重组菌ZWA46-F2和野生菌ZWA46的葡萄糖消耗、生物量、pH值和酒精浓度等过程参数的变化规律基本一致，但前者较后者的发酵周期稍有延迟(3h)。重组菌ZWA46-F2的酒精产量最高达到8.6％(v/v)，乙醇对葡萄糖的转化率达到其理论转化率的89.8％，和野生菌株相同。 6.絮凝重组工业酿酒酵母ZWA46-F2的细胞回用反复分批发酵共进行了26批次，结果表明，第6批次的发酵强度达到最大值2.27g/lh，比第一批次普通分批发酵提高了78.7％。酒精浓度在第11和12批次时达到最大值9.0％(v/v)，此时糖转化率为0.50g/g。当细胞回用至22批次时，发酵强度为1.26g/lh，和第一批次相当，随后逐渐下降，因此，重组菌ZWA46-F2反复分批发酵的细胞回用次数以22批次为宜。 7.利用絮凝重组工业酿酒酵母ZWA46-F2进行连续发酵，发酵强度最大值达到3.82g/lh；重组菌ZWA46-F2单级连续发酵耦合细胞回用反复分批发酵，即把重组菌经5批细胞回用反复分批发酵后再进行单级连续发酵，发酵强度进一步得到提高，最大值达到5.82g/lh。 8.四种发酵工艺的结果表明，单级连续发酵的酒精发酵强度是普通分批发酵的3倍，单级连续发酵耦合细胞回用反复分批发酵的发酵强度是细胞回用反复分批发酵的2.6倍，说明酒精生产的连续发酵工艺明显优于分批发酵。且单级连续发酵耦合细胞回用反复分批发酵的发酵强度比单级连续发酵提高了52.4％，表明利用单级连续发酵耦合细胞回用反复分批发酵的工艺，可以达到高产率和高得率的酒精生产目标。 9.分离纯化得到絮凝重组酿酒酵母W303-1AF4的胞壁蛋白Flo1p，并进行Westemblot分析，表明絮凝蛋白Flo1p分子量大小约200kDa左右；考察了来自S.cerevisiaeW303-1A的絮凝蛋白Flo1p的特征，该蛋白活性受甘露糖抑制，而不受葡萄糖、麦芽糖、蔗糖及半乳糖抑制，实验表明，S.cerevisiaeW303-1A的胞壁絮凝蛋白Flo1p属于典型的Flo1型。胞壁絮凝蛋白Flo1pN端活性区域研究表明，第196至209个氨基酸是Flo1p结合甘露糖的活性区域；第210至240个氨基酸，不是该蛋白与甘露糖结合的活性区域，但是该区域对絮凝蛋白Flo1p与甘露糖结合的活性有一定影响。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要符号对照表

声明

第一章绪论

1.1概述

1.2世界燃料酒精工业的发展现状

1.3酒精的发酵工艺

1.3.1高浓度酒精发酵

1.3.2连续发酵

1.3.3细胞固定化

1.4酿酒酵母的絮凝研究

1.4.1酵母絮凝的遗传因子研究

1.4.2酵母絮凝的影响因素

1.4.3酵母絮凝的遗传工程

1.4.4酵母絮凝蛋白Fl01p的研究

1.5本课题立题背景和研究内容

参考文献

第二章絮凝重组菌Saccharomyces cerevisiae W303-1A F4的构建

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1菌株和质粒

2.2.2培养基

2.2.3培养方法

2.2.4工具酶和试剂

2.2.5主要仪器

2.2.6分子克隆技术

2.2.7分析方法

2.2.8重组菌发酵实验

2.3结果与讨论

2.3.1含酿酒酵母絮凝基因FLO1的重组质粒pYX-FLO的构建

2.3.2酿酒酵母絮凝基因FLO1的核苷酸序列分析

2.3.3重组质粒pYX-FLO转化S.cerevisiae W303-1A

2.3.4重组酿酒酵母W303-1A F4的絮凝能力及絮凝传代稳定性

2.3.5初始pH值对重组酿酒酵母W303-1A F4的絮凝能力的影响

2.3.6葡萄糖浓度对重组菌W303-1A F4絮凝性能的影响及絮凝启动点

2.4本章小结

参考文献

第三章安琪酵母絮凝基因工程菌Ay-F12的构建

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1菌株和质粒

3.2.2培养基

3.2.3发酵方法

3.2.4工具酶和试剂

3.2.5主要仪器

3.2.6分子克隆技术

3.2.7质粒pYX-FLO-kan的构建

3.2.8分析方法

3.3结果与讨论

3.3.1重组质粒pYX-FLO-kan的构建及验证

3.3.2重组质粒pYX-FLO-kan转化安琪酵母

3.3.3重组菌A ngel yeast F12的絮凝性能

3.3.4初始pH值对重组菌A ngel yeast F12絮凝性能的影响

3.3.5重组菌Ay-F12的发酵性能

3.3.6温度对重组菌Ay-F12絮凝性能的影响

3.3.7不同温度条件下重组菌Ay-F12的发酵

3.3.8重组菌Ay-F12的细胞回用反复分批发酵

3.4本章小结

参考文献

第四章工业酿酒酵母絮凝基因工程菌ZWA46-F2的构建

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1菌株和质粒

4.2.2培养基

4.2.3培养方法

4.2.4工具酶和试剂

4.2.5主要仪器

4.2.6分子克隆技术

4.2.7分析方法

4.3结果与讨论

4.3.1重组质粒pYX-FLO-kan转化S. cerevisiae ZWA46

4.3.2重组菌ZWA46-F2的絮凝性能

4.3.3初始pH值对重组菌ZWA46-F2絮凝性能的影响

4.3.4温度对重组菌ZWA46-F2絮凝性能的影响

4.3.5葡萄糖浓度对重组菌ZWA46-F2絮凝性能的影响及絮凝启动点

4.3.6重组菌ZWA46-F2的发酵特性

4.3.7重组菌ZWA46-F2和Ay-F12的比较

4.4本章小结

参考文献

第五章工业酿酒酵母絮凝基因工程菌ZWA46-F2生产酒精的发酵工艺研究

5.1引言

5.2材料与方法

5.2.1菌株

5.2.2培养基

5.2.3发酵方法

5.2.4分析方法

5.3结果与讨论

5.3.1絮凝重组酵母ZWA46-F2细胞回用的反复分批发酵

5.3.2絮凝重组酵母ZWA46-F2的连续发酵

5.3.3絮凝重组酵母ZWA46-F2的连续发酵耦合细胞回用反复分批发酵

5.3.4几种发酵结果的比较

5.4本章小结

参考文献

第六章酿酒酵母絮凝蛋白Flo1p的研究

6.1引言

6.2材料与方法

6.2.1菌株和质粒

6.2.2培养基

6.2.3培养方法

6.2.4工具酶和试剂

6.2.5主要仪器

6.2.6分子克隆技术

6.2.7酵母质粒的提取

6.2.8酵母阳性重组子的鉴定

6.2.9酵母胞壁蛋白F1o1p的分离和纯化

6.2.10酵母胞壁蛋白SDS-PAGE分析

6.2.11酵母胞壁蛋白Flo1p的western blot鉴定

6.2.12单糖类抑制酵母细胞絮凝的分析

6.2.13 Flo1p的N端序列分析

6.2.14分析方法

6.3结果与讨论

6.3.1酿酒酵母胞壁蛋白Flo1p的分离纯化及Western blot鉴定

6.3.2单糖对酿酒酵母胞壁蛋白Flo1p絮凝性能的抑制作用及Flo1p的分类

6.3.3酿酒酵母胞壁蛋白Flo1p的N端活性区域研究

6.4.本章小结

参考文献

主要结论

创新点

攻读博士学位期间发表的论文

致谢