拟无枝酸菌转化洛伐他汀为无锡他汀的发酵优化及无锡他汀的初步提取

摘要

他汀类药物属于羟甲基戊二酰辅酶A(HMG—CoA)还原酶抑制剂，为降脂药物中的首选药物，也是国内外研究的热点之一。无锡他汀(本实验室拥有自主知识产权)是一种新型HMG—CoA还原酶抑制剂，由洛伐他汀经拟无枝酸菌(Amycolatopsissp.ST2710)转化产生。本论文主要对Amycolatopsissp.ST2710转化洛伐他汀为无锡他汀的发酵条件进行了研究，并对转化产物无锡他汀分离提取进行初步探索。 首先，在摇瓶水平上研究发酵条件对Amycolatopsissp.ST2710菌体形态、洛伐他汀转化率的影响。通过对培养基初始pH值、装液量、接种方式、接种量和摇床转速等因素对菌体形态影响的考察。结果表明，当菌丝球大小较均匀，菌球为直径0.5～0.7mm时有利于洛伐他汀的转化。故剪切力的大小是影响洛伐他汀的转化效率的关键因素。同时，考察了洛伐他汀溶液对Amycolatopsissp.ST2710生长的影响，洛伐他汀临界抑制浓度为1.5g/L，洛伐他汀添加浓度以1.0g/L为宜；洛伐他汀转化的适宜温度为28℃，与菌体生长期的最适温度一致；经发酵条件优化后，最佳发酵条件为：培养基初始pH7.0～8.0、装液量25mL/250mL三角瓶、接种方式为孢子接种、接种量10％、摇床转速为120r/min，无锡他汀的产量可达0.48g/L。 根据摇瓶水平分批发酵最优条件，对菌株Amycolatopsissp.ST2710进行5L发酵罐分批发酵试验。分别考察搅拌转速对溶氧、菌体量、菌体形态和洛伐他汀转化的影响。结果表明，转速为300r/min时能提供充足的氧气使细胞快速生长；而较低的转速(200r/min)能在转化阶段减少泡沫的产生，有利于洛伐他汀的转化。基于不同搅拌转速下的洛伐他汀转化率的变化情况，提出了分阶段搅拌转速控制策略：第一阶段，菌体生长期搅拌转速300r/min；第二阶段，洛伐他汀转化期搅拌转速200r/min。经实验验证，采用搅拌转速控制策略，菌体生长末期，菌体量达4.02g/L，至转化结束时，无锡他汀产量达0.50g/L，发酵周期为80h，比摇瓶发酵缩短了16h。为有效减缓底物洛伐他汀的抑制，进行了5L罐补料分批发酵研究。对洛伐他汀采用补料分批发酵，产物产量达1.21g/L，与未补料发酵相比产量提高1.4倍。 此外，从5种树脂中筛选出HP20树脂，对发酵液中无锡他汀进行分离提取，考察了HP20树脂的吸附、解吸效果及影响因素。静态实验表明，非极性树脂HP20对无锡他汀的吸附容量为89.89mg(无锡他汀)/g(干树脂)，最佳吸附pH为7.0左右，适宜吸附时间为3h左右，洗脱剂为丙酮水溶液，洗脱率达95.3％。动态实验确定吸附流速为1.0BV/h时，每毫升湿树脂对发酵液中无锡他汀的吸附量为60mg，较佳的上样浓度为0.9～1.1g/L，用丙酮水溶液进行分阶段梯度洗脱，含无锡他汀的洗脱液为无色，无锡他汀回收率和浓度分别达75％和95％。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1HMG-CoA还原酶抑制剂

1.1.1 HMG-CoA还原酶抑制剂研究进展

1.1.2 HMG-CoA还原酶抑制剂基本结构与分类

1.1.3 HMG-CoA还原酶抑制剂抑制机理

1.2他汀类物质的微生物转化

1.2.1微生物转化的一般过程

1.2.2几种HMG-CoA还原酶抑制剂的微生物转化

1.3发酵工艺条件的选择

1.4大孔吸附树脂

1.4.1大孔吸附树脂的性质和分离原理

1.4.2大孔吸附树脂吸附作用的影响因素

1.4.3利用大孔吸附树脂分离有机化合物的影响因素

1.4.4大孔吸附树脂的预处理及再生

1.5立题背景及本文的主要研究内容

1.5.1立题背景

1.5.2本论文研究的目的和内容

第二章Amycolatopsis sp.ST2710转化洛伐他汀摇瓶发酵条件研究

2.1引言

2.2材料

2.2.1菌种

2.2.2培养基

2.2.3主要仪器

2.2.4主要试剂

2.3方法

2.3.1洛伐他汀溶液的配制

2.3.2培养方法

2.3.3发酵液的处理

2.3.4转化率的测定方法

2.3.5菌丝球直径的测定方法

2.3.6细胞干重的测定方法

2.4结果与讨论

2.4.1菌体形态与转化率的关系

2.4.2不同接种方式对菌体形态和转化率的影响

2.4.3接种量对菌球体形态和转化率的影响

2.4.4初始pH值对菌球体形态和转化率的影响

2.4.5剪切力对菌体形态和转化率的影响

2.4.6装液量对菌体形态和转化率的影响

2.4.7洛伐他汀浓度对菌体浓度和转化率的影响

2.4.8转化温度对转化率的影响

2.5本章小结

第三章 5L罐发酵生产无锡他汀的发酵条件研究

3.1引言

3.2材料

3.2.1菌种

3.2.2培养基

3.2.3主要仪器

3.2.4主要试剂

3.3方法

3.3.1洛伐他汀溶液的配制

3.3.2培养方法

3.3.3发酵液的处理

3.3.4转化率的测定方法

3.4结果与讨论

3.4.1发酵罐搅拌转速对菌体生长和洛伐他汀转化率的影响

3.4.2消泡剂的添加量对洛伐他汀转化率的影响

3.4.3 5L发酵罐间歇发酵过程分阶段搅拌转速控制策略的确定及验证

3.4.4 5L发酵罐洛伐他汀间歇补料发酵

3.5本章小结

第四章大孔树脂对无锡他汀的初步分离提取

4.1引言

4.2材料

4.2.1吸附树脂

4.2.2吸附原液的制备

4.2.3主要仪器

4.3方法

4.3.1树脂的预处理

4.3.2树脂选择

4.3.3静态实验

4.3.4动态实验

4.3.5检测方法

4.4结果与讨论

4.4.1大孔吸附树脂的筛选结果

4.4.2静态吸附试验

4.4.3动态吸附和解吸

4.5本章小结

第五章主要结论及展望

5.1主要结论

5.2展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文