Bacillus subtilis WSHDZ-01产过氧化氢酶的提取、纯化及性质研究

摘要

过氧化氢酶(Catalase，简称CAT)，能够催化H2O2分解为H2O和O2，被广泛用于食品消毒、临床分析、医学诊断以及纺织、造纸、制浆等工业。随着环保意识的加强，在纺织染整工艺中采用酶替代传统的强碱高温工艺对棉织物进行前处理已得到了广泛的应用。过氧化氢酶在棉织物前处理过程中的主要作用是去除织物漂白废液中残余的H2O2，以消除对后续染色工序的影响。 本论文研究了BacillussubtilisWSHDZ—01胞内过氧化氢酶的化学提取、纯化方法及其酶学性质，并通过添加各种稳定剂增强过氧化氢酶应用的稳定性。 主要研究结果如下： (1)采用氯仿冲击法来释放BacillussubtilisWSHDZ—01胞内CAT，在37℃条件下20μL氯仿处理0.01gDCW菌体30min，在水溶液中渗透60min后释放CAT的酶活，可以达到超声波破碎的85％以上。 (2)粗酶液经乙醇分级沉淀、DEAE阴离子交换层析柱、疏水层析柱后，所得过氧化氢酶样品的比酶活由1982.4U/mg提高到了13563.8U/mg，纯化倍数为6.8，回收率达到32.5％。该过氧化氢酶的亚基分子量为63kD，在405nm处显示特征吸收峰(Soretband)，推测含有血红素。计算获得酶的表观米氏常数为26.87mmolL/L。该过氧化氢酶不受低亚硫酸钠的还原作用影响，但被氰化物、叠氮化物和3-氨基-1，2,4—三唑(单功能过氧化氢酶的专一抑制剂)强烈抑制。以邻苯二胺作为电子供体测定酶活时，该酶不显示过氧化物酶活性，因此，将该过氧化氢酶定性为单功能过氧化氢酶。 (3)BacillussubtilisWSHDZ—01所产CAT在pH5-10的范围内催化活性基本上不受pH的影响，最适pH为12，并且在pH6-11的范围内表现出良好的稳定性，25℃条件下放置60min后基本没有酶活损失。最适酶促反应温度为55℃；酶的热稳定性实验表明，该酶在50℃以下相当稳定，保温60min后的酶活基本保持不变。 (4)研究了在BacillussubtilisWSHDZ—01所产CAT中添加糖类、多羟基醇类、金属离子、阴离子和其他一些化学物质对酶应用稳定性的影响，在添加500mmol/L乙酸钠、500mmol/L硫酸钠和50％乙二醇和聚乙二醇后，都可以将酶液在60℃下保温15min后的残余酶活提高至80％以上。 (5)而通过在各温度下对BacillussubtilisWSHDZ—01所产CAT失活过程的研究发现，原酶的热失活过程更符合一级失活模型，而在添加乙酸钠和硫酸钠后的该酶的失活过程则符合二级失活模型。通过热力学性质研究，可以发现原酶不仅在相对高温条件下稳定性较差，并且其稳定性随着温度改变而变化较大，而添加两种稳定剂后，则很大程度上可以提高酶在高温条件下的热稳定性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1过氧化氢酶的研究

1.1.1过氧化氢酶的概述

1.1.2过氧化氢酶的分类及主要性质比较

1.1.3过氧化氢酶的应用

1.1.4国内外研究概况

1.2胞内酶(蛋白)的提取

1.3酶(蛋白质)的纯化

1.3.1蛋白质纯化方法

1.3.2蛋白质分离纯化的程序

1.3.3蛋白质混合物的分离方法

1.4论文的研究意义、目的和主要研究内容

1.4.1研究意义

1.4.2研究目的

1.4.4主要研究内容

第二章胞内Bacillus subtilis WSHDZ-01过氧化氢酶的提取

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1菌种、培养基及培养条件

2.2.2主要仪器

2.2.3试剂

2.2.4分析方法

2.3结果和讨论

2.3.1氯仿对酶释放的影响

2.3.2温度对酶释放的影响

2.3.3水溶液pH对酶释放的影响

2.3.4菌体浓度对酶释放的影响

2.3.5超声波破碎与氯仿冲击法比较

本章小结

第三章Bacillus subtilis WSHDZ-01过氧化氢酶的分离纯化及性质研究

3.1引言

3.2材料和方法

3.2.1菌种、培养基及培养条件

3.2.2主要仪器

3.2.3主要试剂及耗材

3.2.4分析方法

3.2.5催化性质研究

3.2.6光学性质研究

3.2.7分子性质研究

3.3结果与讨论

3.3.1 Bacillus subtilis WSHDZ-01过氧化氢酶的分离纯化

3.3.2催化性质研究

3.3.3过氧化物酶活性测定

3.3.4光学性质研究

3.3.5分子性质研究

3.3.6.Bacillus subtilis WSHDZ-01过氧化氢酶与其它过氧化氢酶的总结比较

3.4本章小结

第四章Bacillus subtilis WSHDZ-01过氧化氢酶热稳定性的研究

4.1引言

4.2材料和方法

4.2.1主要仪器

4.2.2试剂

4.2.3分析方法

4.3结果和讨论

4.3.1原CAT热失活过程

4.3.2添加稳定剂对CAT应用稳定性研究

4.3.2添加稳定剂对CAT的热失活过程的影响

4.4本章小结

第五章结论

致 谢

参考文献

附录： 作者在攻读硕士学位期间发表的论文