纤维蛋白溶解酶的发酵制备、分离纯化及酶学性质研究

摘要

微生物种类繁多、分布广泛，从自然界中筛选纤维蛋白溶解酶产生菌，进一步开发高效、特异、安全、廉价的新型溶栓药物具有巨大的社会价值和经济价值。本文从虾酱中分离、筛选出一株纤维蛋白溶解酶产生菌，经纤维蛋白平板检测，表现较强的溶栓效果，并对其进行生理生化性质鉴定，结合16S rDNA序列分析，经中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC)鉴定为芽孢杆菌，定命名为Bacillus sp. nov. SK006(CCTCC NO.:M205071)。
　　 本文在摇瓶水平上对该菌发酵产酶的培养基组成进行了优化，并当以葡萄糖为碳源，浓度为2%，胰蛋白胨为氮源，浓度为3%，Na2HPO4·12H2O1.5%、NaH2PO4·2H2O0.13%、MgSO4·7H2O0.05%、CaCl20.01%，初始pH7.0，种龄为18 h，装液量为50mL/250 mL，接种量为3%，37℃、180 r/min。
　　 进一步使用5L全自动发酵罐对发酵过程的温度、pH和通气量变化对产酶的影响进行了研究，确定了阶段变温策略：0-36 h控制在37℃培养，36 h后至发酵过程结束控制在30℃；阶段调整通气量策略：在菌体的对数生长期，适当加大通气量有利于细胞的积累从而提高酶的产量。
　　 在5L发酵罐研究结果的基础上，构建BP神经网络模型来模拟Bacillus sp.nov。SK006发酵生产纤维蛋白溶解酶过程，对发酵过程的生物量和纤维蛋白溶解酶的产量进行初步拟合、预测，结果表明，BP网络模型对纤维蛋白溶解酶的预测非常具有参考价值。
　　 通过Native-PAGE对Bacillus sp. nov. SK006发酵液进行初步活性鉴定，发现发酵液中含有多种具有纤溶活性的同工酶，通过乙醇沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析等一系列分离纯化手段，将其中两种主要的纤维蛋白溶解酶(SPFE-1与SPFE-2)纯化至电泳纯，并结合SDS-PAGE和凝胶过滤对酶的纯度和分子量进行鉴定，分析结果表明，这两种纤维蛋白溶解酶均为单体酶，分子量分别为46.0 kDa和12.3 kDa。
　　 SPFE-1在50℃以下相对稳定，在30-40℃保温4h，相对酶活仍在60%左右，在50℃保温2h，也能保持60%以上的酶活，而SPFE-2稳定性稍差，但在40℃以下保温2h仍然保持较高的活力，总的说来，SPFE-1和SPFE-2具有较好的耐热性。
　　 SPFE-1与SPFE-2在比较宽的pH范围内都保持稳定，尤其SPFE-2在pH4.0-8.0的范围内稳定性较强。
　　 金属离子和酶抑制剂对酶活的影响研究表明：Mg2+和Co2+对SPFE-1几乎没有影响，而Zn2+能增强酶活力，EDTA、Cu2+、Ca2+、Mn2+、Fe3+、Fe2+和Hg2+则分别对酶产生了不同程度的抑制作用，其中以Cu2+，Hg2+抑制作用最为强烈；PMSF和PCMB对SPFE-1的酶活也表现出较为强烈的抑制作用，推测SPFE-1是一种丝氨酸蛋白酶，且活性中心存在半胱氨酸基团。对于SPFE-2来说，Cu2+和Ca2+促进酶活，而Zn2+却抑制酶活。2-mercaptoethanol对酶活也有抑制作用，推测Zn2+与SPFE-2活性中心催化部位的-S-S-结合，改变了酶的催化能力。低浓度的EDTA即可完全抑制SPFE-2，说明SPFE-2可能是一种金属蛋白酶。
　　 SPFE-1与SPFE-2对底物具有高度专一性，它们的最适底物为N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA，该底物是枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)或胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)的最适底物，也是纳豆激酶的最适底物。采用Hanes-Woolf法作图法，求得它们作用最佳底物的特征常数分别为Km:0.60/0.51 mmol/L；kcat:712.93/154.25S-1； kcat/Km:1.19×106/3.02×105 L·s-1 mol-1(SPFE-1/SPFE-2)。
　　 SPFE-1与SPFE-2都既可以直接降解纤维蛋白，还对纤维蛋白溶解酶原有激活作用，从而间接降解纤维蛋白。
　　 在对纤维蛋白原的降解过程中，SPFE-1最先降解纤维蛋白原的β链，然后是α链，很难降解γ链，而SPFE-2顺次降解α、β和γ链。
　　 SPFE-1与SPFE-2的N-端氨基酸序列的前13个残基相同，依次为：AQSVPYEQPHLSQ，虽然与几种芽孢杆菌来源的纤维蛋白溶解酶有一定程度的同源性，但不完全相同于现已发现的纤维蛋白溶解酶。
　　 圆二色性分析表明，SPFE-2中β-折叠与回转结构为0，而SPFE-1中存在较大比例的更稳定的β-折叠。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1.1 血栓栓塞性疾病

1.1.1 血栓的形成机理

1.1.2 纤溶

1.2 血栓栓塞疾病的治疗

1.2.1 溶栓药物的研究进展

1.2.2 溶栓剂的主要来源

1.3 发酵食品中的溶栓剂

1.3.1 传统发酵食品纤维蛋白溶解酶种类

1.3.2 不同传统发酵食品纤维蛋白溶解酶同源性比较

1.3.3 微生物发酵法产纤维蛋白溶解酶的研究进展

1.4 纤维蛋白溶解酶活性测定方法

1.4.1 合成发色基质S-2251测定法(Synthetic substrate S-2251 method)

1.4.2 紫外分光光度计(275nm)测定法

1.4.3 纤维蛋白平板法

1.4.4 纤维蛋白块溶解时间法

1.4.5 微量稀释法

1.4.6 四肽底物法

1.4.7 血清板法

1.5 本课题的立题依据和意义

1.6 本课题的研究内容

参考文献

第二章 纤维蛋白溶解酶产生菌种的分离、筛选及鉴定

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 主要材料

2.2.2 主要仪器

2.2.3 菌株及保藏条件

2.2.4 培养基

2.2.5 菌种筛选及鉴定

2.2.6 遗传稳定实验

2.3 结果与讨论

2.3.1 菌种的筛选

2.3.2 菌种鉴定

2.3.3 遗传稳定研究试验

2.4 本章小结

参考文献

第三章 Bacillus sp.nov.SK006发酵产酶过程分析及工艺研究

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验材料

3.2.2 实验方法

3.2.3 分析方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 芽孢杆菌Bacillus sp.nov.SK006的种子生长曲线

3.3.2 发酵培养基进一步优化

3.3.3 发酵条件的优化

3.3.4 发酵罐(5L)扩大培养条件优化

3.4 本章小结

参考文献

第四章 发酵过程动力学模型研究

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 实验材料

4.2.2 实验方法

4.2.3 分析方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 BP网络模型的理论基础

4.3.2 5L发酵罐的发酵实验

4.3.3 发酵罐扩大培养生物量模型的建立

4.4 本章小节

参考文献

第五章 两种纤维蛋白溶解酶的分离、纯化及鉴定

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 菌种及保藏方法

5.2.2 主要实验材料

5.2.3 主要实验仪器

5.2.4 主要实验方法

5.3 结果与讨论

5.3.1 乙醇分级沉淀

5.3.2 Native-PAGE活性鉴定

5.3.3 DEAE-Sepharose CL 6B Fast Folw离子交换层析

5.3.4 Superdex 75(10/300 GL)凝胶过滤层析

5.3.5 纯化结果及SDS-PAGE电泳鉴定

5.3.6 SPFE-1与SPFE-2的活性鉴定

5.4 本章小结

参考文献

第六章 两种纤维蛋白溶解酶的酶学性质研究

6.1 前言

6.2 材料与方法

6.2.1 实验材料

6.2.2 主要实验仪器

6.2.3 主要实验方法

6.3 结果与讨论

6.3.1 温度对酶活及热稳定性的影响

6.3.2 pH对酶活及稳定性的影响

6.3.3 金属离子及酶抑制剂对酶活的影响

6.3.4 SPFE-1和SPFE-2水解酪蛋白活力测定

6.3.5 SPFE-1和SPFE-2的底物专一性及反应动力学常数测定

6.3.6 对纤维蛋白溶解酶原的激活作用研究

6.3.7 对纤维蛋白原的作用方式

6.3.8 N-端结构分析

6.3.9 SPFE-1和SPFE-2的圆二色性(circular dichroism，CD)

6.4 本章小结

参考文献

论文主要结论

论文创新点

附录：N-端结构分析图谱及标准氨基酸分析图谱

致谢

攻读博士学位期间发表的论文成果