癞葡萄籽油甘油三酯结构及其体外抗肿瘤功效研究

摘要

癞葡萄(MCV)是苦瓜的一个变种。癞葡萄籽油的主要成分是甘油三酯(TG，85.43%)，主要特征脂肪酸(FA)为共轭亚麻酸(CLn，55.13%)，所含三种CLn异构体以α-桐酸为主(51.54%)；癞葡萄籽油是多种含CLn的TG的混合物。
　　 目前国内外对苦瓜籽油及其特征FA的抗结肠肿瘤的活性已作了大量研究，但迄今为止，关于苦瓜籽油中的TG的抗肿瘤活性研究仍为空白。人们普遍认为FA是油脂的抗肿瘤功效的最基本功能单元，完全忽略了油脂的TG层次对抗肿瘤功效的贡献；还认为TG在人体内一定先水解成游离脂肪酸(FFA)才被吸收利用，所以认为TG结构对其功效是不重要的，FA组成才是关键的。本论文比较了含CLn的MCVTG与FFA形式的CLn的抗某种肿瘤的功效，研究了含CLn的MCVTG的结构与抗肿瘤功效的关系。
　　 本论文分析了癞葡萄籽的化学组成，其中癞葡萄籽仁的含油率为32%；测试了癞葡萄籽油的基本化学性质；分析了癞葡萄籽油的FA组成，鉴定了主要特征FA。
　　 发现AOCS推荐的猪胰脂酶定向水解法和猪胰脂酶定向水解-2-苯乙酮衍生化-HPLC法不适于分析癞葡萄籽油的FA分布；癞葡萄籽油混合TG的13C-NMR分析揭示癞葡萄籽油中TG的sn-2位置主要由CLn占据。从桐油中分离得到纯的三α-桐酸甘油酯，补充了文献中缺少的由α-桐酸构成的AAA型TG的13C-NMR数据。
　　 癞葡萄籽油混合TG经NARP-HPLC分离，用APCI-MS进行初步结构鉴定，共分离鉴定出20种TG，TG中都含有CLn，以CLn占据sn-2位的TG为主；用HPLC分离制备的两个纯的癞葡萄籽油TG组分，再用13C-NMR法分析它们的FA分布，所得结果与APCI-MS结构鉴定结果一致。采用酶促酯交换法合成了结构预计为SSCLn的TG，它是癞葡萄籽油中的结构为SCLnS的TG的位置异构体，也用APCI-MS鉴定其结构，结果正如预计，证明了APCI-MS法鉴定TG结构的适用性。
　　 选择α-桐酸作为药物对照组，采用体外细胞培养方法，通过体外试验，考察了癞葡萄籽油混合TG和六组癞葡萄籽油分离TG对五种人体消化系统肿瘤细胞增殖的影响，初步探讨了TG的结构或组成与油脂的抗肿瘤功效的关系。六组不同MCVTG分别对5个人体消化系统的肿瘤细胞系的细胞增殖有大小不一的阻抗效果，除了对结肠癌细胞增殖的抑制作用不如α-桐酸外，癞葡萄籽油中含CLn的TG对另4个人体肿瘤细胞系的增殖抑制作用都比α-桐酸强，提示FFA状态的CLn比TG状态的功效弱。对正常肝细胞增殖虽有抑制作用，但强度不高；MCVTG及α-桐酸对肿瘤细胞的增殖的影响均有明显的量效关系，但时间-效应关系不明显。
　　 综合来看，结构为SCLnS的MCVTG抗人体肿瘤的活性最佳，且对多种肿瘤细胞增殖有抑制作用，尤其是在低浓度时对人胃癌细胞株SGC-7901、人口腔癌细胞KB和人肝癌细胞株Bel-7402作用显著，而SCLnS在MCVO中的含量较少。本文以MCVO或桐油为原料，在1，3位特异性脂肪酶的定向催化下，利用酯交换反应使MCVO或桐油中的TG向SCLnS转化，并优化了酶促酯交换反应条件。SSCLn和SCLnS抗肿瘤功效的比较还不能证明CLn在甘油骨架上的位置与功效有关。MCVTG可能最终通过CLn起抗肿瘤作用，即CLn的脂质过氧化机制是MCVTG抗肿瘤的基础；但MCVTG这种CLn的甘油三酯形态可延缓CLn的氧化率，保护CLn的生理功能，从而最大限度地发挥抗肿瘤功效。
　　 从脂肪酸组成、TG组成与结构、相近组分对各细胞株的细胞增殖抑制作用等方面比较了MCVTG和桐油TG，有可能帮助我们认识MCVTG抗肿瘤的结构性因素，同时有可能促进开发桐油中含量巨大的α-桐酸资源。
　　 采用溶剂分提法(无水乙醇-正己烷混合溶剂)富集了结构为SCLnCLn的癞葡萄籽油TG组分，该组分占癞葡萄籽油TG的60%左右，可经NARP-HPLC分离纯化得到单一组分，对人胃癌细胞株SGC-7901增殖具有很强的抑制作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写符号说明

声明

第一章 绪论

1.1 癞葡萄和苦瓜概述

1.2 苦瓜与癞葡萄的主要化学成分研究

1.2.1 三萜类

1.2.2 甾体类

1.2.3 蛋白质、多肽类及氨基酸

1.2.4 有机酸类(含脂肪酸)

1.2.5 生物碱类

1.2.6 糖类

1.2.7 微量元素

1.2.8 癞葡萄主要成分

1.2.9 苦瓜籽的主要化学成分

1.3 苦瓜与癞葡萄的药用价值

1.3.1 降血糖作用

1.3.2 对糖尿病并发症的治疗作用

1.3.3 抗肿瘤作用

1.3.4 抗病毒作用

1.3.5 抗菌抗炎防腐作用

1.3.6 抗生育作用

1.3.7 抗氧化作用

1.3.8 免疫调节作用

1.4 苦瓜抗肿瘤作用机理研究进展

1.4.1 苦瓜蛋白质和苦瓜素的抗肿瘤作用机理

1.4.2 苦瓜籽油及其主要脂肪酸抗肿瘤作用机理

1.5 油脂中的甘油三酰酯及其分离纯化、结构分析的研究现状

1.5.1 甘油三酯的分离方法

1.5.2 脂肪酸分布的分析方法

1.5.3 甘油三酯结构的分析方法

1.6 立题依据和意义

1.7 主要研究内容

参考文献

第二章 癞葡萄籽油的基本性质及脂肪酸组成与分布

2.1 前言

2.2 材料与仪器

2.2.1 材料

2.2.2 主要仪器

2.3 实验方法

2.3.1 出仁率检验

2.3.2 癞葡萄籽主要成分分析

2.3.3 癞葡萄籽油的化学性质测试

2.3.4 癞葡萄籽油脂肪酸组成分析

2.3.5 癞葡萄籽油的共轭亚麻酸的制备与表征

2.3.6 甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯含量测定

2.3.7 猪胰脂酶定向水解法分析癞葡萄籽油的脂肪酸分布

2.3.8 猪胰脂酶定向水解-HPLC法分析癞葡萄籽油的脂肪酸分布

2.3.9 三α-桐酸甘油酯HPLC制备与表征

2.3.10 13C-NMR法分析癞葡萄籽油的脂肪酸分布

2.4 结果与讨论

2.4.1 出仁率

2.4.2 癞葡萄籽(带壳)主要成分分析

2.4.3 癞葡萄籽油的化学性质

2.4.4 癞葡萄籽油脂肪酸组成分析

2.4.5 癞葡萄籽油中的共轭亚麻酸的表征

2.4.6 甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯含量

2.4.7 猪胰脂酶定向水解法分析癞葡萄籽油的脂肪酸分布

2.4.8 猪胰脂酶定向水解-HPLC法分析癞葡萄籽油的脂肪酸分布

2.4.9 三α-桐酸甘油酯的表征及13C-NMR数据

2.4.10 13C-NMR法分析癞葡萄籽油的脂肪酸分布

2.5 本章小结

参考文献

第三章 癞葡萄籽油甘油三酯的分离纯化及结构研究

3.1 前言

3.2 材料与仪器

3.2.1 材料

3.2.2 主要仪器

3.3 实验方法

3.3.1 癞葡萄籽油的提取与纯化

3.3.2 癞葡萄籽油TG的NARP-HPLC/APCI-MS分析

3.3.3 癞葡萄籽油TG的HPLC制备与表征

3.3.4 癞葡萄籽油CLn的提取

3.3.5 硬脂酸占据sn-2位的含共轭亚麻酸的甘油酯的合成与表征

3.3.6 癞葡萄籽油TG的NMR分析

3.4 结果与分析

3.4.1 NARP-HPLC/APCI-MS对癞葡萄籽油的甘油三酯结构的判定

3.4.2 13C-NMR对癞葡萄籽油甘油三酯结构的判定

3.5 本章小结

参考文献

第四章 癞葡萄籽油甘油三酯体外抗肿瘤活性研究

4.1 前言

4.2 材料与仪器

4.2.1 材料

4.2.2 主要仪器

4.3 实验方法

4.3.1 癞葡萄籽油的提取与纯化及桐油的提取

4.3.2 α-桐酸的制备及鉴定

4.3.3 Sn-1(3)，2-二硬脂酸-3(1)-共轭亚麻酸甘油酯的合成

4.3.4 合成TG与癞葡萄籽油TG的NARP-HPLC分离制备

4.3.5 试验样品配制

4.3.6 细胞培养

4.3.7 肿瘤细胞增殖抑制实验

4.3.8 溶剂对试验样品作用于细胞的影响

4.3.9 Hoechst33342-PI染色

4.3.10 实验数据处理

4.4 实验结果

4.4.1 α-桐酸的表征

4.4.2 NARP-HPLC分离收集的癞葡萄籽油TG各峰对应组分

4.4.3 不同浓度溶剂对细胞增殖的影响

4.4.4 MCVO中不同TG对不同肿瘤细胞存活率的影响

4.4.5 Hoechst33342-PI染色检测胃癌细胞SGC-7901和肝癌细胞Bel-7402细胞核变化

4.5 讨论

4.5.1 共轭亚麻酸抗肿瘤的主要机制

4.5.2 MCVTG抗肿瘤的可能机制

4.6 本章小结

参考文献

第五章 桐油甘油三酯与癞葡萄籽油甘油三酯的比较

5.1 前言

5.2 材料与仪器

5.2.1 材料

5.2.2 主要仪器

5.3 实验方法

5.3.1 桐油的提取与纯化

5.3.2 桐油的FA组成分析

5.3.3 桐油TG的NARP-HPLC/APCI-MS分析

5.3.4 桐油TG的HPLC制备与表征

5.3.5 桐油TG的NMR分析

5.3.6 细胞培养

5.3.7 肿瘤细胞生长抑制实验

5.3.8 实验数据处理

5.4 结果与分析

5.4.1 桐油的脂肪酸组成分析及其与MCVTG的比较

5.4.2 13C-NMR法分析桐油的脂肪酸分布

5.4.3 桐油的甘油三酯组成与结构分析及其与MCVTG的比较

5.4.4 不同试验样品对肿瘤细胞存活率的影响

5.4.5 MCVTG与桐油TG的抗肿瘤功效比较

5.5 本章小结

参考文献

第六章 癞葡萄籽油中特异甘油三酯的富集、转化

6.1 前言

6.2 材料与仪器

6.2.1 材料

6.2.2 主要仪器

6.3 实验方法

6.3.1 溶剂法分提SCLnCLn

6.3.2 酶法酯交换转化SCLnS

6.3.3 HPLC检测

6.3.4 TG纯化

6.3.5 纯SCLnCLn、SCLnS制备

6.3.6 APCI-MS检测鉴定

6.3.7 抑制肿瘤细胞生长实验

6.4 结果与分析

6.4.1 溶剂法分提SCLnCLn

6.4.2 酶法酯交换转化SCLnS

6.4.3 富集和酯交换反应产物的抗肿瘤功效

6.5 本章小结

参考文献

主要结论

主要创新点、展望

附录

致谢

作者在攻读博士学位期间发表的论文