提高重组E.coli产胆固醇氧化酶水平的研究

摘要

胆固醇氧化酶(EC1.1.3.6 COD)在食品加工、医疗检测、生物抗虫等方面的作用日益受到人们的重视，并且显示出巨大的应用潜力。本文主要研究产COD重组E.coli的发酵优化，目的提高产酶水平。
　　 在摇瓶中优化了重组E.coli JM109的发酵培养基、诱导条件以及环境条件。结果表明，起始甘油浓度10mL/L:起始胰蛋白胨和酵母粉浓度分别为10g/L和5g/L；并在早期添加0.3mmol/L的IPTG诱导6h；以摇床转速180r/min、装液量15%、起始pH7.5、培养温度37℃以及5%的接种量为培养条件；使得摇瓶中产酶水平达到1686.57U/L。为优化前700U/L的2.4倍。
　　 研究不同的底物流加方式，实现重组E.coli的高密度培养。研究发现恒pH-stat法虽然可以获得较高的菌体干重42.68g/L(DCW)，但是其发酵周期长(36h)，不利于生产强度的提高；分段指数流加策略，实现了短时间内菌体的高密度培养，DCW在第14h达到40.13g/L。对高密度培养中诱导时机的优化中发现，均在发酵中期诱导效果佳，使得菌体产酶水平达到6436.56U/L，生产强度达到459.75U/(L·h)，实现了重组E.coli产COD的高效表达和高效生产的统一。为优化前700U/L的9.2倍。
　　 研究以廉价无毒的乳糖代替昂贵有毒的IPTG，诱导重组E.coli表达COD的实验中发现，乳糖一方面可以作为碳源供菌体生长，另一方面又可以诱导外源基因的表达。研究中还发现在添加乳糖诱导时，菌体对乳糖有个大约10h适应期。以复合流加碳源基质(甘油和乳糖)，诱导重组E.coli表达COD的研究中发现该方法并没有消除菌体对乳糖的适应期，但是采用恒pH-stat法的流加策略，克服了因适应期的长期饥饿而产生的负面影响，使得产酶水平达到6005.66U/L，为IPTG诱导的93.3%，生产强度为200.19U(L·h)，为IPTG诱导的47.4%。

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声明

第一章 绪论

1.1 胆固醇氧化酶的研究背景

1.1.1 COD的来源和分布

1.1.2 COD酶活力的测定

1.1.3 COD的基因克隆和表达研究

1.1.4 COD的应用研究

1.2 重组大肠杆菌的高密度发酵

1.2.1 限制高密度发酵的主要因素

1.2.2 高密度发酵的方法

1.3 课题的研究意义及内容

第二章 材料与方法

2.1 菌种

2.2 主要设备

2.3 主要试剂

2.4 培养基

2.5 培养方法

2.6 分析方法

2.6.1 菌体破碎

2.6.2 酶活力测定

2.6.3 细胞光密度分析与菌体生物量的测定

2.6.4 甘油质量浓度的测定

2.6.5 乙酸质量浓度的测定

第三章 结果与讨论

3.1 产COD重组E.coli的摇瓶发酵条件优化

3.1.1 发酵培养基的优化

3.1.2 培养基优化后的生长曲线

3.1.3 诱导条件的优化

3.1.4 培养条件对COD发酵生产的影响

3.1.5 发酵培养基中乙酸浓度对COD发酵生产的影响

3.2 产COD重组E.coli的高密度发酵

3.2.1 分批发酵

3.2.2 补料分批发酵

3.3 重组E.coli产COD的乳糖诱导策略

3.3.1 乳糖诱导外源基因表达的摇瓶研究

3.3.2 分批发酵中一次补加乳糖诱导的研究

3.3.3 分批发酵中流加乳糖诱导的策略

3.3.4 高密度发酵中乳糖的诱导策略

3.3.5 高密度发酵中提高生产强度的研究

论文结论

致谢

参考文献

附录