基于内外源胁迫诱导的Bacillus subtilis过氧化氢酶发酵优化和发酵过程放大

摘要

过氧化氢酶(CAT)高效催化H2O2分解为H2O和O2。微生物过氧化氢酶因其广泛的来源和优良的性质越来越受到研究者的青睐。部分微生物产过氧化氢酶已实现工业化。目前国内市场上微生物过氧化氢酶正逐步取代牛肝过氧化氢酶，具有很好的市场前景。国内前期研究发现，实现过氧化氢酶工业化生产的最主要问题是要解决总酶活偏低，发酵液中酶含量较少这两大问题。本文以一株高产过CAT的Bacillus subtilis WSHDZ-01为研究菌株，研究内外源胁迫下Bacillus subtilis WSHDZ-01的发酵过程及在工业化中的实际应用。主要的研究内容与结果如下：
　　 ⑴通过研究比较后选定最优内源胁迫物为乙醇:在发酵0h添加2.0%(v/v)的乙醇时，与未添加的对照组比较，CAT总酶活和胞内酶活分别提高了126%和150%。乙醇不同的添加方式对菌体产酶的促进程度也不一样，为了最大程度地促进Bacillus sp.WSHDZ-01产酶，考察了乙醇不同的添加方式，发现:在0 h、12 h、36 h分别添加2.0%(v/v)的乙醇，发酵结束时CAT酶活达到了15000 U/mL，较对照6450 U/mL提高了132.6%，这说明多次乙醇胁迫更能有效地促进CAT的过量合成。基于多次分批添加乙醇后乙醇的消耗速率，设计了分阶段恒速流加乙醇的发酵策略进一步提高乙醇的产量，CAT总酶活(28990 U/mL)和胞内酶活(9691 U/mL)均达到最大值，发酵周期缩短为42 h，实现了CAT的高酶活(28990U/mL)和高生产强度(470 U/(mL·h))的统一，为过氧化氢酶的工业化生产奠定了基础。
　　 ⑵表面活性剂不能促进Bacillus sp.WSHDZ-01合成CAT，而添加外源胁迫物H2O2能胁迫菌体产酶并促进酶的分泌。即，在发酵12 h添加0.3%(V/v)H2O2可使发酵液中CAT水平提高43.5%。在耐受范围内，H2O2少量多次添加能更好促进菌体产酶:在12 h和24 h分两次添加0.15%的H2O2时，总酶活可达9744U/mL，比对照提高了51%。当乙醇和H2O2同时胁迫Bacillus sp.WSHDZ-01时，胞外酶比总酶活的比例达82.5%为高效提取CAT奠定基础。
　　 ⑶经过放大计算和实际经验确定搅拌转速、通气量和罐压后，采用分批添加乙醇的方法胁迫菌体产酶。结果发现，发酵罐体积放大到30 L后菌体生长优于在3L罐中的生长，但是产酶时间延后，CAT酶活在发酵54 h时达到最大值34700 U/mL，CAT的生产强度为643 U/mL/h。在1吨发酵罐中，为保证发酵前期发酵液中的溶氧，搅拌转速前期160 r/min，后期100 r/min，采用通风量0.2-0，4vvm。细胞干重在54 h达到最大值3.2 g/L，CAT酶活在发酵64 h时达到最大值18240 U/mL，CAT的生产强度为285 U/mL/h。胞内酶活在54 h后达到稳定9000U/mL，胞外酶活在60 h后超过胞内酶活最大可达10036 U/mL。在5吨发酵罐中，采用通风量0.4 vvm，搅拌转速100 r/min，前期温度38-39℃后期温度33-35℃。CAT酶活在发酵64 h时达15000 U/mL，CAT的生产强度为234.4 U/(mL·h)，其中胞外酶活在70 h时达11000 U/mL，占总酶活的73%，方便下游提取。结果表明利用Bacillus sp.WSHDZ-01进行工业化产CAT是完全可行的，在未来的研究中可以将分阶段温度控制的策略或乙醇添加策略具体应用到实际工业化生产中进一步提高酶活。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 引言

1.1 研究背景

1.1.1 过氧化氢酶概述

1.1.2 国内外微生物过氧化氢酶的工业化生产近况

1.1.3 不同来源商品过氧化氢酶性质的比较

1.2 立题依据

1.2.1 过氧化氢酶与胁迫物的关系及在微生物细胞中的分布优化

1.2.2 菌株的选择

1.3 研究内容

第二章 材料与方法

2.1 菌种

2.2 培养基

2.3 培养方法

2.4 分析方法

2.4.1 生物量的测定

2.4.2 酶液样品的制备

2.4.3 过氧化氢酶活测定

2.4.4 还原糖的测定

2.4.5 超氧化物歧化酶的测定

2.5 乙醇测定

2.6 仪器

第三章 结果与讨论

3.1 内源胁迫促进Bacillus subtilis WSHDZ-01合成CAT

3.1.1 内源胁迫物种类对CAT合成的影响

3.1.2 乙醇的添加量和添加时间对CAT合成的影响

3.1.3 乙醇的添加方式对CAT合成影响的比较

3.1.4 最优乙醇添加方式下CAT的合成

3.1.5 小结一

3.2 H2O2对CAT从胞内向胞外分泌的促进作用

3.2.1 有效促进CAT向胞外分泌的添加物的确定

3.2.2 外源胁迫物H2O2的添加量和添加时间对CAT合成的影响

3.2.3 H2O2的添加方式对CAT合成影响的比较

3.2.4 乙醇和H2O2的分别添加对CAT在细胞内外分布的影响

3.2.5 乙醇和H2O2的混合添加对CAT合成及分泌的影响

3.2.6 小结二

3.3 Bacillus subtilis WSHDZ-01合成CAT的放大研究

3.3.1 发酵过程实验室放大(30L)

3.3.2 工业规模发酵罐的放大研究(1t)

3.3.3 工业规模发酵罐的放大研究(5t)

3.3.4 小结三

3.4 结论

致谢

参考文献

附录：攻读硕士学位期间取得的学术成果