光滑球拟酵母中ATP的生理功能与作用机制

摘要

本文以一株能在胞外大量积累丙酮酸的光滑球拟酵母的(Torulopsis glabrata)四重维生素(硫氨酸、生物素、吡哆醇和烟酸)营养缺陷型菌株CCTCC M202019为研究对象，以阐明能量代谢对酵母生理过程的影响为目标，在初步了解T.gtabrata中能量代谢途径的基础上，运用代谢工程和微生物生理学的理论和方法，就ATP代谢途径如何调控酵母胞内微环境，并影响细胞生长与产物积累的机制展开研究。主要研究结果如下：
　　 (1)有机整合融合PCR、酵母高效电转化、制霉菌素富集和限制性培养基筛选等技术手段，建立了一种针对酵母的无抗性标记并可重复使用的大片段缺失营养缺陷型菌株构建方法，并成功构建了尿嘧啶缺陷型(△ura3)、精氨酸缺陷型(△arg8)和尿嘧啶精氨酸双缺陷型(△ura3△arg8)等三株T.glabrata营养缺陷型菌株。在此基础上，验证了含有2μm片段的酵母载体在T.glabrata中的稳定性，并实现了增强型绿色荧光蛋白的可诱导表达；
　　 (2)ATP8、ATP6和ATP9基因分别编码F0Fl-ATP合成酶的三个重要亚基，均位于线粒体基因组上(mtDNA)。以一个线粒体重新编码的ARG8m基因作为筛选标记，利用同源重组策略敲除ATP8、ATP6和ATP9基因。在这一过程中发现，野生型和转化的mtDNA能同时存在于转化子中，且随着培养条件的改变，两种mtDNA所占的比例会发生规律性变化。作者将这一现象命名为单细胞线粒体基因组多态性(Single cellmitochondrial genome polymorphism，SCMGP)。研究表明，mtDNA不稳定性、线粒体融合/分裂过程和mtDNA的选择性丢失是形成SCMGP现象的主要因素。在理解SCMGP现象形成机制的基础上，建立了利用厌氧培养消除SCMGP现象的策略，获得了三株仅含有目标mtDNA的同质体ATP8、ATP6和ATP9缺失菌株，并分别命名为ATP8、ATP6和ATP9；
　　 (3)ATP6缺失可以导致T.glabrata在基本培养基和精氨酸补充培养基中培养24代后的mtDNA丢失率分别达到42%和63%。胞内ATP水平、活性氧(Reactive oxygen species，ROS)浓度、线粒体膜间腔(Mitochondrial intermembrane space，MIMS)中的pH值、跨膜电势(△ψm)及乌头酸酶的表达水平与酶活性均表明，MIMS中H+的过量积累是导致ATP6缺失突变株mtDNA不稳定的关键因素。当细胞缺失ATP6基因后，发挥离子通道作用的α亚基丢失，导致MIMS中积累的H+无法通过F0F1-ATP合成酶得到释放，导致ROS水平升高，干扰线粒体基质蛋白的定位，系统性的影响mtDNA的稳定性。为了提高ATP6敲除突变菌株mtDNA在不同培养条件下的稳定性，将来源于荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)的交替氧化酶基因AOX1和来源于乳酸乳球菌(Lactobacillus lactis)的NADH氧化酶基因noxE表达于ATP6缺失突变株中，显著提高了mtDNA稳定性，两株菌分别命名为AOX和NOX；
　　 (4)以前面得到的一系列ATP合成酶缺失突变株为对象，研究了胞内ATP水平变化对细胞生理过程的影响。ATP8、ATP6和ATP9三个基因的敲除显著降低了ATP水平，强烈的抑制了细胞的生长，48 h时的菌体干重分别降低了46.9%、44.2%和59.8%。在发酵初期，由于F0F1-ATP合成酶活性缺失导致的胞内ATP水平下降，ATP8、ATP6、ATP9和NOX的胞内ATP水平分别为出发菌株的65.5%、62.0%、48.4%和73.0%。ATP水平的降低显著解除了ATP对糖酵解途径关键酶活性的抑制，加速了糖酵解速率。但随着发酵继续进行至28 h后，ATP合成酶缺失菌株的糖酵解速率显著下降。研究表明，ATP合成酶缺失菌株中ATP水平的显著下降和ROS水平的显著提高，导致细胞抵御酸胁迫和渗透压胁迫的能力显著下降。在胞质中表达NADH氧化酶基因noxE可以促进NADH代谢，降低胞内ROS水平，改善胞内微环境，从而促进细胞生长和丙酮酸的积累。代谢网络通量、中心代谢途径关键酶表达水平和酶活性分析表明，F0F1-ATP合成酶缺失对胞质中的糖酵解途径具有显著影响，而对位于线粒体基质中的三羧酸循环影响较小，表明线粒体的亚细胞区隔可以有效保护其中进行的物质合成和产能代谢途径；
　　 (5)真核微生物细胞依靠一系列ATP酶，利用水解ATP产生的能量，进行H+和其它离子的转运，以维持各亚细胞区隔间的pH梯度。当胞外pH较低时，细胞需要消耗更多的ATP维持更高的pH梯度。为了研究胞内ATP水平在细胞应对胁迫过程中的作用，通过在培养基中添加柠檬酸盐促进ATP供给，研究低pH条件下T.glabrata的细胞生长和丙酮酸生产。结果表明，ATP供给的增强显著促进了依赖于ATP的胞内pH平衡过程，使培养基、胞质和液泡之间的pH梯度得到显著提高。pH梯度与胞内ATP浓度之间的量化关系表明胞内ATP浓度的上升可以显著的促进相关的pH平衡过程。此外，T.glabrata CCTCC M202019的pH平衡能力显著弱于其它常见的酵母菌株，可能也是其可以快速积累丙酮酸的一个重要原因。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1.1 概述

1.2 国内外研究进展

1.2.1 胞内微环境对微生物细胞生长和产物积累的重要作用

1.2.2 胞内ATP供给水平的调控策略

1.2.3 基于ATP水平调控的发酵过程优化

1.3 本论文主要研究内容

1.3.1 调控胞内ATP供给优化发酵过程中仍存在的问题

1.3.2 本论文的主要研究内容

第二章 光滑球拟酵母基因操作系统的构建

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 菌株和质粒

2.2.2 培养基及相关溶液

2.2.3 试剂、酶、引物、Marker及相关试剂盒

2.2.4 分子生物学操作

2.3 结果与讨论

2.3.1 G418抗性试验

2.3.2 敲除框的构建

2.3.3 缺陷型突变株的富集与筛选

2.3.4 营养缺陷型突变株的验证

2.3.5 增强型绿色荧光蛋白的可诱导表达

2.3.6 质粒稳定性

2.4 本章小结

第三章 线粒体基因敲除过程中的单细胞线粒体基因组多态性

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 菌株和质粒

3.2.2 培养基和相关溶液

3.2.3 分子生物学操作

3.2.4 分析方法

3.3 结果

3.3.1 线粒体转化

3.3.2 mtDNA转化子在YPG平板上生长

3.3.3 mtDNA转化子选择性丢失mtDNA(Δatp6::ARG8m)

3.3.4 mtDNA异质性的存在

3.3.5 寡霉素和厌氧培养降低mtDNA(△atp6::ARG8m)的丢失率

3.3.6 厌氧培养对线粒体和mtDNA拷贝数的影响

3.3.7 厌氧培养降低ATP6/ARG8m比例

3.3.8 mtDNA(ATP6)的消除

3.4 讨论

3.4.1 真核细胞中的SCMGP现象

3.4.2 以T.glabrata mtDNA转化子作为模型研究SCMGP现象

3.4.3 mtDNA不稳定性在SCMGP现象中的作用

3.4.4 mtDNA的选择性丢失

3.4.5 厌氧状态下的线粒体融合/分裂过程促进mtDNA同质体的筛选

3.5 本章小结

第四章 膜间腔中质子的过量积累导致ATP6缺失菌株mtDNA不稳定

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 菌株和质粒

4.2.2 培养基及培养条件

4.2.3 NADH氧化酶和交替氧化酶的表达

4.2.4 分析方法

4.3 结果

4.3.1 NADH氧化途径对ATP6敲除菌株中mtDNA稳定性的影响

4.3.2 T.glabrata及其突变株的胞内ATP浓度

4.3.3 T.glabrata及其突变株的胞内ROS浓度

4.3.4 MIMS中H+的过量积累

4.3.5 ATP6缺失菌株中△ψm的不均一性

4.3.6 乌头酸酶的转录与定位分析

4.4 讨论

4.4.1 nDNA编码的基因未受影响

4.4.2 ARG8m置换ATP6的过程中并未引起GC簇和重复序列的变化

4.4.3 胞内ATP浓度不是导致mtDNA不稳定性的主导因素

4.4.4 ROS生成量增加是导致ATP6缺失菌株中mtDNA不稳定性的重要因素

4.4.5 MIMS中的低pH影响线粒体基质蛋白的定位

4.4.6 MIMS中的低pH增加ROS的生成

4.4.7 NADH氧化途径对中膜间腔中质子积累过程的影响

4.5 本章小结

第五章 ATP合成酶亚基缺失对光滑球拟酵母中心代谢途径的影响

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 菌株

5.2.2 培养基

5.2.3 培养方法

5.2.4 分析方法

5.3 结果

5.3.1 ATP合成酶基因敲除及noxE的表达对发酵特性的影响

5.3.2 代谢网络分析

5.3.3 ATP合成酶基因敲除及noxE的表达对胞内ATP水平的影响

5.3.4 ATP合成酶基因敲除及noxE的表达对低pH和渗透压耐受性的影响

5.3.5 中心代谢关键酶基因的转录分析

5.3.6 中心代谢途径关键酶活性分析

5.4 讨论

5.4.1 ATP水平、胞内微环境与细胞生长和碳中心代谢的关系

5.4.2 ATP合成酶亚基缺失后的NAD+再生方式对中心代谢途径的影响

5.4.3 EMP和TCA中关键酶基因表达及活性水平对中心代谢途径的影响

5.4.4 线粒体区隔对于中心代谢途径的保护作用

5.5 本章小结

第六章 依赖ATP的pH平衡过程在细胞抵御酸胁迫中的作用

6.1 前言

6.2 材料与方法

6.2.1 菌株

6.2.2 培养基和培养方法

6.2.3 分析方法

6.3 结果

6.3.1 柠檬酸促进低pH值条件下T.glabrata的生长

6.3.2 胞外pH值对胞内ATP浓度的影响

6.3.3 柠檬酸添加促进能量代谢

6.3.4 提高ATP浓度促进pH梯度的维持过程

6.3.5 pH值对糖酵解关键酶活性的影响

6.3.6 pH梯度与胞内ATP浓度的关系

6.4 讨论

6.4.1 细胞抵御酸胁迫的主要机制

6.4.2 柠檬酸在增强ATP合成中的作用

6.4.3 pH平衡过程在丙酮酸积累过程中的作用

6.4.4 提高耐受酸胁迫能力的重要意义

6.5 本章小结

结 论

论文创新点

致谢

参考文献

附录