曲霉CJ22-326产壳聚糖酶基因的克隆、表达与定点突变

摘要

壳聚糖酶可以专一性地水解壳聚糖，生成在很多领域都有着广泛应用的低聚壳聚糖。但是已报道的微生物产壳聚糖酶的酶活力普遍较低。本实验室从大海淤泥中成功筛选到了一株产壳聚糖酶菌株曲霉CJ22-326。此菌株可以在壳聚糖诱导培养基中产内切壳聚糖酶(CSN)和外切壳聚糖酶(CSX)。为了进一步提高壳聚糖酶的活力，本研究运用分子生物学的方法，对酶的基因进行了克隆和表达并对重组酶进行了定点突变研究。
　　 本论文首先对CJ22-326进行了菌种的分子生物学鉴定。使用真菌通用引物NS1和NS8，以基因组DNA为模板，PCR扩增得到了曲霉的18s rDNA序列。对PCR产物进行鉴定和测序，结果发现CJ22-326与曲霉属的Aspergillus niger，Aspergillus proliferans，以及青霉属的Penicillium expansum和Penicillium chrysogenum KCTC6052等菌株的相似性均达到了96%。但是根据孢子形态特征，发现它不属于其中任何的菌种，我们认为它是曲霉属的新菌种。
　　 利用3’-RACE(rapid amplification of cDNA ends)和5’-RACE的方法，使用简并引物，扩增得到了编码曲霉CJ22-326内切壳聚糖酶的cDNA，对其结构进行分析，根据分析结果设计了一对特异引物，成功扩增到了编码曲霉CJ22-326内切壳聚糖酶cDNA的结构基因(717 bp)，此基因序列已在Genbank数据库申请登记，登记号为EU302818。为了获得曲霉CJ22-326外切壳聚糖酶的编码序列，利用RT-PCR的方法，扩增得到了编码外切壳聚糖水解酶的cDNA。根据cDNA序列分析结果，进一步扩增出了来源于曲霉CJ22-326的外切壳聚糖水解酶的编码序列(2652 bp)。该序列已在Genbank数据库申请登记，登记号为FJ449570。
　　 将内切壳聚糖酶和外切壳聚糖酶的cDNA结构基因分别插入到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)中，构建重组质粒pET28a-CSN和pET28a-CSX。将重组载体pET28a-CSN转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，重组菌在IPTG诱导下表达出有活性的重组内切酶，经SDS-PAGE检测和Western-blot鉴定，重组大肠杆菌有分子量约为29 kDa的蛋白表达带。采用不同的温度和IPTG诱导浓度，对重组内切酶的表达条件进行了优化。发现当温度为37℃，IPTG诱导浓度为1 mM时，蛋白质的表达量最高。重组质粒pET28a-CSX转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中之后，在IPTG诱导下表达出有活性的重组外切酶，SDS-PAGE和Western-blot检测到约100 kDa的蛋白表达带。使用Ni-NTA亲和层析对重组内切酶和重组外切酶进行了亲和纯化，分别得到了2.3 mg/L和1.2 mg/L蛋白质。使用DNS法对重组内切酶和重组外切酶的酶活力进行了测定，分别为1.18 U/mL和6.96 U/mL。
　　 通过测定酶解液体系的粘度和对酶解产物的薄层层析分析，发现重组酶CSN以内切的方式水解壳聚糖的β-(1，4)糖苷键。而重组酶CSX是以外切的方式作用于壳聚糖的分子一端，依次切下氨基葡萄糖残基。对重组酶的酶学性质进行研究，结果表明：重组内切酶的最适pH值是6，最适反应温度是65℃，Km和Vmax分别为0.826 mg/ml和0.094mg/ml-min；重组外切酶的最适pH值是4.1，最适反应温度是50℃，Km和Vmax分别为0.146 mg/ml·min和7.758 mg/ml。重组内切酶和重组外切酶具有高度的底物专一性，除了对不同脱乙酰度的壳聚糖有作用以外，对几丁质和CMC没有水解活力。两者的反应速率均随着底物脱乙酰化度的提高而增加。
　　 运用定点突变的方法，对保守的谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)进行定点突变后，发现Glu169和Asp160在突变后完全丧失了内切壳聚糖酶的活力。使用圆二色谱对野生酶与突变酶的二级结构进行研究，发现E169Q的结构和野生酶以及其它保持一定活力的突变酶(D160E)基本保持一致。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1.1 目的意义

1.2 壳聚糖酶的国内外研究现状与进展

1.2.1 壳聚糖酶的性质

1.2.2 壳聚糖酶的分子生物学研究

1.3 目前壳聚糖酶研究尚存在的问题

1.4 本课题的主要研究内容

第二章 内切型壳聚糖酶基因的克隆与表达

2.1 前言

2.2 材料和方法

2.2.1 材料

2.2.2 实验方法

2.3 结果

2.3.1 CJ22-326的分子生物学鉴定

2.3.2 曲霉CJ22-326的RNA提取

2.3.3 3’-RACE和5’-RACE扩增

2.3.4 内切壳聚糖酶编码基因的扩增

2.3.5 重组酶与其它真菌壳聚糖酶氨基酸序列的比较

2.3.6 内切壳聚糖酶氨基酸序列的进化分析

2.3.7 内切壳聚糖酶基因表达载体的鉴定

2.3.8 重组壳聚糖酶的表达与纯化

2.3.9 重组内切酶的性质

2.4 讨论

2.5 本章小结

第三章 外切壳聚糖水解酶的基因克隆与表达

3.1 前言

3.2 材料和方法

3.2.1 材料

3.2.2 实验方法

3.3 结果

3.3.1 反转录及PCR扩增

3.3.2 外切酶基因的扩增

3.3.3 表达载体的构建

3.3.4 外切壳聚糖酶的进化树分析

3.3.5 重组壳聚糖酶的诱导表达和鉴定

3.3.6 重组外切酶的纯化

3.3.7 重组外切酶的性质

3.4 讨论

3.5 本章小结

第四章 内切壳聚糖酶基因的定点突变研究

4.1 前言

4.2 材料和方法

4.2.1 材料

4.2.2 试验方法

4.3 结果

4.3.1 定点突变策略

4.3.2 突变体菌株的生长曲线

4.3.3 定点突变前后的酶活力变化

4.3.4 圆二色谱

4.4 讨论

4.4.1 定点突变策略

4.4.2 维持内切型壳聚糖酶催化活力的必需氨基酸

4.4.3 内切壳聚糖酶定点突变的意义

4.5 本章小结

参考文献

论文主要结论

论文创新点

在校发表论文清单

致谢