重组蛋白GGH在毕赤酵母中高效表达及纯化

摘要

GLP-1是由肠道L细胞合成和分泌的由30个氨基酸组成的多肽，它不仅能促进胰岛素合成，而且能够促进胰β细胞增殖和抑制胰β细胞凋亡。GLP-1独特的降血糖作用机制，是现有抗糖尿病药物无可比拟的，但由于其在体内的半衰期非常短，大大限制了其应用。为克服GLP-1半衰期短的缺点，实现其在体内的长效作用，本实验室成功构建了胰高糖素样多肽-1(GLP-1)突变串联体与人血清白蛋白的表达质粒pPIC9K/(GLP-1A2G)2-HSA，并且初步实现了在毕赤酵母KM71中的表达。在此基础上，本文主要围绕提高融合蛋白GGH的产量和分离纯化进行研究，主要结论如下：
　　 (1)统计分析了融合基因GGH在不同毕赤酵母宿主(KM71、GS115、SMD1168)中的表达，并通过荧光定量PCR研究了三株产量差异较大的GS115重组子基因剂量与融合蛋白GGH表达量的关系，实验结果表明：宿主GS115更有利于融合蛋白GGH的表达，融合蛋白的表达量与目的基因的剂量成正相关，最终确定高一株产菌株GS115/F2，在摇瓶中的稳定表达量为328mg/L。
　　 (2)研究了高表达菌株的发酵过程，确定了其在5L发酵罐上的发酵工艺。实验结果表明有机氮源培养基更有利于融合蛋白GGH高密度表达及控制目的蛋白的降解；在有机氮源培养基中，0.5％的甲醇脉冲式流加方式和30℃诱导温度为最佳诱导条件，最终融合蛋白GGH的产量达到642mg/L。
　　 (3)初步建立了融合蛋白GGH的分离纯化路线，即发酵液8000r/min离心5min，10kDa截留量的超滤膜超滤浓缩20倍，Blue Sepharose亲和吸附、Sephadex G25脱盐、Q Sepharose FF离子交换层析，整个纯化过程回收率为33.4％，经SDS-PAGE和HPLC检测纯度大于95％，符合下一步生物活性和药代动力学实验和药剂学试验的要求。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)概况

1.1.1人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)

1.1.2 GLP-1的生物学作用及临床作用

1.1.3 GLP-1长效类似物的研究进展

1.2人血清白蛋白融合技术

1.2.1人血清白蛋白

1.2.2白蛋白融合技术

1.3毕赤酵母表达系统

1.3.1毕赤酵母(Pichia pastoris)

1.3.2毕赤酵母宿主菌及表达载体

1.3.3毕赤酵母表达系统对外源蛋白表达的影响

1.4毕赤酵母高密度发酵

1.4.1高密度发酵

1.4.2毕赤酵母补料分批发酵

1.5重组蛋白的分离纯化

1.5.1重组蛋白质的特性及分离方法的选择

1.5.2重组蛋白分离纯化的特点

1.6本课题研究的意义和内容

1.6.1本课题研究的意义

1.6.2本课题的研究内容

第二章不同宿主及基因剂量对融合蛋白GGH表达的影响

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1材料

2.2.2方法

2.3结果与分析

2.3.1重组质粒pPIC9K/GGH的提取及其线性化

2.3.2融合基因GGH在不同毕赤酵母表型中的表达及筛选

2.3.3高、中、低产菌株的发酵动力学参数比较

2.3.4荧光定量PCR确定高(GS115/F2)、中(GS115/W8)、低(GS115/I2)产菌株拷贝数的差异

2.3.5 Q-PCR曲线和溶解度曲线

2.3.6(GS115/F2)、中（GS115/W8）、低（GS115/I2）产菌株拷贝数差异

2.4本章小节

第三章诱导条件对高产重组子GS115/GGH表达的影响

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1培养基

3.2.2主要试剂

3.2.3主要仪器

3.2.4培养方法

3.2.5分析方法

3.3结果与讨论

3.3.1种子生长曲线

3.3.2 5L罐中无机氮源培养基与有机氮源培养基发酵过程分析

3.3.3不同的甲醇流加方式对GGH表达量的影响

3.3.4不同的甲醇诱导浓度对GGH表达量的影响

3.3.5不同的温度对GGH表达量的影响

3.3.6优化条件下的5L发酵罐表达GGH

3.4本章小结

第四章融合蛋白GGH的分离纯化

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1材料与试剂

4.2.2主要仪器

4.2.3分离纯化方法

4.2.4纯度检测方法

4.3结果与讨论

4.3.1融合蛋白GGH的超滤浓缩过程

4.3.2 Blue Sepharose层析

4.3.3凝胶过滤层析

4.3.4融合蛋白GGH的离子交换过程

4.3.5融合蛋白GGH的脱盐

4.3.6融合蛋白GGH纯化工艺总结

4.3.7融合蛋白GGH的纯度鉴定

4.4本章小结

结论与展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文