Amycolatosis CGMCC No1149 P450酶对洛伐他汀羟基化的影响及P450酶基因部分克隆

摘要

他汀类药物属于羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，为降脂药物中的首选药物，也是国内外研究的热点之一。无锡他汀(本实验室拥有自主知识产权)是一种新型HMG-CoA还原酶抑制剂，由洛伐他汀经拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.ST2710)转化产生。本文主要对Amycolatopsis sp.ST2710转化洛伐他汀为无锡他汀的转化过程中的相关酶进行了初步的研究，分析了转化过程中相关酶的酶活与洛伐他汀转化之间的关系，并克隆了该酶的部分基因序列，初步确定该酶为CYP450羟基化酶。
　　 首先，在国内外文献的基础上，确立Amycolatopsis CGMCC No1149 P450酶测定方法为一氧化碳差光谱法，这一方法是根据还原型P450酶与CO结合以后在450nm处有一特征吸收峰的特性建立的。对Amycolatosis CGMCC No1149 P450酶测定方法进行了优化。主要考察了破壁方法，温度，pH以及缓冲体系对酶活测定的影响。最终确立酶活测定条件：以超声波破碎细胞获得细胞抽提液，温度为室温，缓冲体系为pH7.4磷酸缓冲液，CO结合时间2 min，紫外分光光度计从400 nm向500 nm扫描。其中波长450 nm处的吸光率即代表了该CYPP450羟基化酶的酶活。
　　 为了判断P450酶与底物羟基化的关系，考察了Amycolatopsis CGMCC No1149 P450酶对洛伐他汀转化率的影响。通过改变培养基初始pH，转化温度，底物浓度，溶氧等因素，考察P450酶活的变化及相应的洛伐他汀转化率的变化。结果发现，pH，温度，底物浓度，溶氧等均对P450的酶活有较大影响，其变化趋势与转化率的变化一致。同时，研究了在添加适量金属离子情况下P450酶活变化情况，其中添加Mg2+、Fe2+、Cu2+后酶活有显著提高，同时对转化又明显的促进作用。研究结果表明，洛伐他汀的转化跟Amycolatopsis sp.ST2710中的细胞色素P450酶的酶活性密切相关。
　　 通过对所查到的CYP450基因的序列进行分析，利用保守区进行简并PCR，克隆了P450酶基因部分基因片段，其长度为0.52 kb，经序列分析发现其与Amycolatopsis azureaCYP450基因核苷酸序列相似性最高，同源性达到了92％。对该基因片段所编码的氨基酸序列进行了分析，并与其他相关的CYP450氨基酸片段做了同源性比对，发现它们之间的同源性大都超过了60％，为同一亚家族成员。从而在分子生物学的角度初步判断CYP450是Amycolatopsis sp.ST2710转化洛伐他汀为无锡他汀过程中的一个相关酶。

目录

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声明

第一章绪论

1.1 HMG-CoA还原酶抑制剂的作用机理

1.2 HMG-CoA还原酶抑制剂研究进展

1.3 HMG-CoA还原酶抑制剂的基本结构与分类

1.4微生物对他汀类物质的转化

1.4.1微生物对美伐他汀的转化

1.4.2微生物对辛伐他汀的转化

1.4.3微生物对洛伐他汀的转化

1.5细胞色素P450

1.5.1细胞色素P450酶系简介

1.5.2细胞色素P450酶系的结构与功能

1.5.3细胞色素P450催化的反应类型

1.5.4细胞色素P450的催化循环机制

1.5.5细胞色素P450酶系的应用

1.6本研究的立题背景和内容

1.6.1立题背景

1.6.2本论文的研究目的和内容

第二章材料与方法

2.1材料

2.1.1菌种和质粒

2.1.2主要仪器

2.1.3试剂

2.1.4培养基

2.2方法

2.2.1实验方法

2.2.2洛伐他汀转化率及产物的测定方法

2.2.3待测酶液的制备

2.2.4细胞色素P450酶活力检测方法

2.2.5 PCR引物

2.2.6 Amycolatopsis sp.ST2710染色体DNA的制备

2.2.7 PCR扩增反应体系及反应条件

2.2.8 PCR产物克隆

2.2.9大肠杆菌感受态细胞制备

2.2.10转化大肠杆菌

2.2.11质粒DNA的提取

第三章结果与讨论

3.1酶活力测定体系

3.1.1 Amycolatosis CGMCC No1149 P450酶测定方法的选择

3.1.2缓冲体系对Amycolatosis CGMCC No1149 P450酶测定的影响

3.1.3破壁方法对Amycolatosis CGMCC N01149 P450酶测定的影响

3.1.4底物浓度对Amycolatosis CGMCC No4449 P450酶测定的影响

3.1.5温度对Amycolatosis CGMCC No1149 P450酶测定的影响

3.1.6 pH对Amycolatosis CGMCC No1149 P450酶测定的影响

3.2 Amycolatosis CGMCC No1149 P450酶对洛伐他汀羟基化的影响

3.2.1洛伐他汀羟基化过程中P450酶活性对转化影响

3.2.2洛伐他汀羟基化过程中温度对P450酶活性及转化率的影响

3.2.3洛伐他汀羟基化过程中底物浓度对P450酶活性及转化率的影响

3.2.4洛伐他汀羟基化过程中pH对P450酶活性及转化率的影响

3.2.5洛伐他汀羟基化过程中不同离子对P450酶活性及转化率的影响

3.2.6洛伐他汀羟基化过程中溶氧对P450酶活性及转化率的影响

3.3 Amycolatosis CGMCC No1149 P450酶部分基因克隆与序列分析

3.3.1根据保守区序列克隆P450基因部分序列

3.3.2克隆基因的序列分析

3.3.3所得序列的遗传密码分析

3.3.4所得序列的同源性分析

3.4结论与展望

3.4.1主要结论

3.4.2展望

致谢

参考文献

附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文