重组胆固醇氧化酶表达的发酵优化

摘要

胆固醇氧化酶是一种重要的检测用酶,除广泛应用于医疗检测外,在食品开发、医疗保健、生物农药等方面也有应用潜力。鉴于微生物来源的胆固醇氧化酶表达量小且需要胆固醇诱导的问题,本实验室成功构建了一株可胞内表达胆固醇氧化酶的基因工程菌,但是胆固醇氧化酶主要以包涵体的形式存在,活性胆固醇氧化酶表达量低。本文采取调整诱导剂,优化发酵工艺等手段提高活性胆固醇氧化酶产率,建立一系列胆固醇氧化酶高效表达技术,有助于实现胆固醇氧化酶高效低成本制备。
　　 本文以一株胞内表达胆固醇氧化酶的工程菌E coli BL21(DE3)-PET28a-COD为生产菌株,以减少包涵体形成,提高活性胆固醇氧化酶产率为目标,采用外因优化与内因优化相结合的策略对胆固醇氧化酶发酵过程进行优化。
　　 1.采用乳糖诱导胆固醇氧化酶表达,提高了胆固醇氧化酶可溶表达的比例,并优化了乳糖诱导胆固醇氧化酶表达的条件。采用乳糖诱导胆固醇氧化酶表达,酶活分别为0.76U/mL,0.45U/mg,是IPTG诱导时的4.0和2.4倍,显著提高了活性胆固醇氧化酶的表达水平。在优化后的诱导条件下诱导胆固醇氧化酶表达,酶活达到5.8U/mL,为初始条件的7.6倍。
　　 2.调节诱导阶段温度和pH提高活性胆固醇氧化酶产率,建立双程培养策略。研究了菌体生长和诱导阶段的最佳温度和最适pH,结果表明,菌体生长阶段最佳条件:温度37℃,pH7.5;诱导阶段最适条件:温度30℃,pH6.5。采用双程培养策略培养工程菌,胆固醇氧化酶酶活最终达到16.9U/mL,生产强度为1.30U/(mL·h),分别提高了191％,347％;重组酶表达量占菌体总蛋白的32％,但可溶部分占胆固醇氧化酶表达量的68％,显著提高胆固醇氧化酶的可溶表达水平。
　　 3.7L发酵罐中研究了工程菌的培养策略,进一步提高活性胆固醇氧化酶产率。比较了四种补糖策略,确定采用葡萄糖补料培养菌体至对数生长后期,恒速流加乳糖诱导液诱导重组酶表达的方法获得最大酶活20.5U/mL,提高了21％。制定pH-stat流加甘油乳糖混合诱导液诱导工程菌表达胆固醇氧化酶的策略,产酶量达到25.8U/mL,提高了26％。

目录

文摘

英文文摘

第一章 引言

1.1 胆固醇氧化酶及其来源

1.2 提高重组酶的可溶表达的方法

1.2.1 诱导剂的选择

1.2.2 改变诱导方式

1.2.3 降低培养温度

1.2.4 改变培养基的组成

1.3 重组大肠杆菌高密度发酵补料技术

1.3.1 高密度发酵的限制因素

1.3.2 高密度发酵的补料策略

1.3.3 乳糖诱导的流加策略

1.4 本论文主要研究内容

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌种

2.1.2 试剂

2.1.3 主要仪器

2.1.4 培养基及诱导剂

2.2 培养方法

2.2.1 种子制备

2.2.2 摇瓶培养

2.2.3 分批培养

2.2.4 分批补料培养

2.3 分析方法

2.3.1 菌体浓度测定

2.3.2 蛋白浓度分析

2.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析

2.3.4 胆固醇氧化酶活力测定

2.3.4 其他

第三章 结果与讨论

3.1 诱导物选择对重组COD表达的影响

3.1.1 天然诱导物与合成诱导物诱导COD表达的比较

3.1.2 诱导物调整后的发酵培养基优化

3.1.3 诱导发酵COD的条件确定

3.2 双程培养策略提高活性COD产率的研究

3.2.1 降低培养温度提高活性COD产率的研究

3.2.2 改变诱导阶段pH提高活性COD产率

3.2.3 双程培养提高活性胆固醇氧化酶表达

3.3 7 L发酵罐中综合调整活性COD发酵工艺的研究

3.3.1 分批培养结束后乳糖直接诱导COD发酵工艺

3.3.2 先提高菌浓再提高酶得率的发酵工艺

3.3.3 综合外因和内因优化策略提高活性COD产率的结果

结论

致谢

参考文献

附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文