产β-半乳糖苷酶的节杆菌突变株筛选、发酵条件优化与酶基因保守序列分析

摘要

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC3.2.1.23)是一种能够同时催化水解反应和转苷反应的酶,它可以将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖;半乳糖在其转苷酶活的作用下,与果糖作用生产乳果糖。Β-半乳糖苷酶本身的酶学性质决定了其可以广泛应用于乳糖的降解(如水解乳制品中的乳糖以解决乳糖不耐症等)和功能性低聚糖的生产(如乳果糖、低聚半乳糖等)。本实验室从土壤中筛选得到一株节杆菌Arthrobacter sp.,其β-半乳糖苷酶同时具有水解与转苷两种酶活性。本文从如下4个方面对该菌株进行了进一步研究:
　　 为了提高菌株产β-半乳糖苷酶能力,首先利用亚硝基胍-氯化锂复合诱变,再利用紫外线-氯化锂复合诱变,筛选出一株诱变菌Arthrobacter sp.U14,经过实验证明该菌株β-半乳糖苷酶对底物ONPG的酶活达到2.65 U/mL,比出发菌株酶活0.465U/mL提高470％。
　　 由于节杆菌Arthrobacter sp.所产β-半乳糖苷酶为胞内酶,所以在筛选β-半乳糖苷酶活性提高的菌株的过程中,建立了一种溶菌酶与SDS复合处理裂解细胞,细胞裂解液与X-gal反应显色进行高产菌筛选的方法。溶菌酶终浓度4mg/mL,37℃水浴1.5 h,再加入SDS终浓度1％,37℃水浴20 min。通过该方法可以有效缩小高产菌株的筛选范围,减少工作量,缩短工作时间,同时保持较高的筛选准确度。
　　 以菌株Arthrobacter sp.的乳糖培养基为基础,采用响应面法,对影响Arthrobacter sp.U14产β-半乳糖苷酶活性的发酵培养基成分进行考察和评价。优化后发酵条件:在自然pH值条件下,当乳糖浓度为5.4％,酵母抽提物浓度5.1％,Fe3+浓度0.93 mM时,β-半乳糖苷酶理论预测最大酶活为3.7U/mL。优化后实际测定平均酶活为3.85U/mL。比优化前酶活提高45.3％。
　　 根据已公开发表的节杆菌β-半乳糖苷酶保守区域序列设计引物,对Arthrobacter sp.与Arthrobacter sp.U14进行PCR扩增,得到600 bp长度的β-半乳糖苷酶保守区域的序列。利用DNAMAN软件对克隆出的基因序列进行比对,发现Arthrobacter sp.与Arthrobacter sp.U14在这一段保守区域核苷酸序列上的相似性为97.37％。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 研究背景

1.1.1 β-半乳糖苷酶及其催化的反应

1.1.2 β-半乳糖苷酶的应用

1.1.3 β-半乳糖苷酶的生产

1.1.4 乳果糖

1.1.5 乳果糖的生理作用

1.1.6 乳果糖的生产

1.2 国内外研究进展

1.3 研究意义

1.4 本论文的主要研究内容

第二章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株

2.1.2 培养基

2.1.2 缓冲液

2.1.3 试剂

2.1.4 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 菌体培养及粗酶液制备

2.2.2 β-半乳糖苷酶酶活测定方法(ONPG法)

2.2.3 溶菌酶与SDS复合裂解细胞及细胞裂解液与X-gal的显色反应

2.2.4 亚硝基胍-紫外线-氯化锂复合诱变

2.2.5 响应面法优化发酵条件

2.2.6 β-半乳糖苷酶基因保守区域序列扩增

第三章 实验结果与讨论

3.1 溶菌酶与SDS复合作用测定酶活(X-gal法)

3.1.1 β-半乳糖苷酶与X-gal的显色反应

3.1.2 溶菌酶与SDS复合处理裂解细胞条件

3.2 亚硝基胍-紫外线-氯化锂复合诱变

3.2.1 亚硝基胍-氯化锂复合诱变

3.2.2 紫外线-氯化锂复合诱变

3.2.3 诱变菌株的遗传稳定性试验

3.3 响应面法优化发酵条件

3.3.1 单因素实验

3.3.2 Plackett-Burman实验设计筛选影响显著因素

3.3.3 β-半乳糖苷酶酶活响应面分析与优化

3.4 Arthrobacter sp.与Arthrobacter sp.U14产β-半乳糖苷酶基因保守序列比较

3.4.1 基因组DNA的提取与纯化

3.4.2 β-半乳糖苷酶基因保守区域PCR扩增与序列比对

第四章 结论

致谢

参考文献

附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文