人BRAF V600E突变体真核表达载体的构建及表达

摘要

BRAF是RAS/RAF/MEK/ERK/MA/PK．通路重要的细胞信号转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件。在人类肿瘤的发生和发展过程中，BRAF蛋白可能独立于RAS蛋白而发挥作用，是潜在的诊断标记和治疗靶点。在消化道肿瘤中，BRAF基因存在不同频率的突变，可能影响它们的发生和发展，值得对该基因进一步研究。 目的：构建野生型和V600E突变型人BRAF基因真核表达载体，转染并筛选稳定表达BRAF的胰腺癌细胞株，为探讨BRAF V600E突变在胰腺癌发生和发展中的作用提供合适的细胞模型。 方法：将BRAF基因编码序列分成5个片段：片段1：BRAFl-508(ECORI/Kpnll片段；片段2：BRAF508-1335(KpnI/XhoI)片段；片段3：BRAFl335-1843(XhoI/BamHI)片段；片段3’：BRAFl335．1843(XhoI/BamHI)片段(突变型1799T-A转换)；片段4：BRAFl843-2301(BamHI/SalI)片段。分别设计相应的引物，进行PCR扩增，全合成拼接构建野生型和V600E突变型BRAF基因cDNA序列，插入pUCm-T质粒，进行序列测定，测序正确后将其亚克隆到真核表达载体pCMV-Myc，获得pCMV-Myc．BRAF<'w>和pCMV-Myc-BRAF<'V600E>，测序验证，利用脂质体将重组载体转染胰腺癌细胞株Panc-1，经G418培养筛选获得抗性细胞克隆，用RT-PCR和Western blot鉴定野生型和V600E突变型BRAF基因在Panc-1细胞中的表达。 结果：人工合成的5个片段1：BRAFl-508(EcoRI/KpnI)片段；片段2：BRAF508-1335(KpnI/XhoI)片段；片段3：BRAFl335．1843(XhoI/BamHI)片段；片段3’：BRAFl335-1843(XhoI/BamHI)片段(突变型：T1799A)；片段4：BRAFl843-2301(BamHI/SalI)片段，测序结果显示序列正确，酶切鉴定和序列分析证实重组克隆pCMV-Myc．BRAFw和pCMV-Myc-BRAF<'V600E>序列正确，RT-PCR和Western blot结果表明G418筛选获得的转基因Panc-1细胞稳定表达BRAF和BRAF V600E。 结论：成功构建了pCMV-Myc-BRAF<'w>和pCMV-Myc-BRAF<'V600E>真核表达载体，建立了稳定表达BRAF和BRAF V600E的胰腺癌细胞株。

目录

文摘

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论文说明：缩略词表

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前 言

第一部分BRAF基因的合成

第二部分：BRAF野生型和突变型pCMV-Myc重组克隆的建立

第三部分：细胞转染，筛选稳定的细胞株

讨 论

结 论

参考文献

文献综述BRAF基因突变与消化道肿瘤

作者简介

致 谢