外周血内皮祖细胞的磁粒子标记和MR成像研究

摘要

第一部分：兔外周血内皮祖细胞分离、培养及鉴定的实验研究 目的：探讨新西兰大白兔外周血来源内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)体外分离、培养和扩增的方法，并对培养细胞进行鉴定。 方法：用密度梯度离心法从新西兰兔外周血中分离出单个核细胞(mononuclearcells，MNCs)，通过贴壁筛选得到EPCs，从细胞形态、超微结构、免疫化学、荧光染色、流式细胞仪分析表面标记物及RT-PCR检测mRNA等方面鉴定EPCs，应用MTT法绘制细胞生长曲线，流式细胞分析细胞周期及细胞凋亡情况。 结果：新西兰兔外周血分离得到的MNCs经体外培养呈内皮细胞样形态，电镜下可见内皮细胞特征性WP小体，表达EPCs的表面标志物CD34、CD105、CD106和VEGFR2等，表达VEGFR2、eNOs和vWF的mRNA，显示内吞乙酰化低密度脂蛋白(acLDL)、结合凝集素1(UEA-1)等内皮细胞的功能特性，提示培养细胞具有EPCs的形态、功能和表面蛋白特性；培养18天后，平均可从1ml血中获得(3．09±0．51)×105个细胞，原代细胞传代后第2～5天生长迅速，细胞周期分析示超过90％处于G0／G1期，早期凋亡为11．67±1．18％。 结论：兔外周血中存在具有分化增殖能力的EPCs，可通过密度梯度离心法分离得到，具有干细胞特性，可体外培养、分化为内皮细胞。 第二部分：外周血内皮祖细胞磁粒子标记及MR体外成像研究 目的：应用纳米磁粒子的偶联物Fe2O3-PLL体外标记兔外周血内皮徂细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)，磁共振对标记细胞成像。 方法：制备Fe2O3-PLL，分离兔外周血单个核细胞(mononuclearcells，MNCs)，贴壁法筛选出EPCs，传代培养，标记Fe2O3-PLL，普鲁士兰染色、电子显微镜显示细胞内铁，四氮噻唑蓝(MTT)比色试验评价不同浓度Fe2O3-PLL标记EPCs后对细胞生长的影响，选取适当的标记浓度，显微镜下观察Fe2O3-PLL标记细胞的最佳孵育时间及标记率，原子吸收光谱分析定量细胞内铁，应用MR的不同序列进行体外细胞群成像。 结果：普鲁士兰染色显示蓝色铁颗粒位于细胞浆内，电镜观察细胞核周围的胞浆内存在大量纳米磁粒子；MTT比色试验示10μg／ml至200μg／ml7个铁浓度组，Fe2O3-PLL标记后细胞的光吸收值与未标记者比较差异无统计学意义(P>0．05)，采用低铁浓度(20μg／ml～30μg／ml)标记较为合适，在此浓度下孵育(18～24)h即可有效标记细胞，标记率接近100％；原子吸收光谱分析示随着标记后培养时间的延长，细胞内铁含量降低；MRI显示标记Fe2O3-PLL的细胞群较未标记者信号降低，以T2*WI信号强度变化率最大(P<0．05)，标记后培养7d的信号强度变化率均较标记1d者下降(P<0．05)。 结论：低铁浓度Fe2O3-PLL即可有效标记兔外周血EPCs，随着标记后培养时间的延长，细胞内纳米铁减少，临床应用型1．5TMR可在体外进行标记细胞群成像。 第三部分：Fe2O3-PLL标记内皮祖细胞对细胞生物学特性影响的实验研究 目的：应用自行合成的超顺磁性纳米铁粒子复合物Fe2O3-PLL标记新西兰免外周血内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)，探讨其对细胞增殖、功能、分化等生物学特性的影响。 方法：合成Fe2O3-PLL复合物。分离兔外周血单个核细胞(mononuclearcells,MNCs)，贴壁法筛选出EPCs，Fe2O3-PLL标记EPCs，电子显微镜显示细胞内铁及内皮细胞的特征性小体Weibel-Palade小体，四氮噻唑蓝(MTT)比色试验比较未标记细胞与25ug／mlFe2O3-PLL标记细胞后生长曲线的差异，流式细胞分析检测标记、未标记细胞的表面标记物表达、细胞周期及细胞凋亡情况，NO、NOS检测试剂盒分析未标记、标记后培养不同时间细胞的NO含量、NOS活性差异，激光共聚焦显微镜下观察并分析Fe2O3-PLL标记细胞后对细胞内钙离子浓度及膜流动性的影响情况，RT-PCR检测未标记、标记后培养1、7天细胞的VEGFR2、eNOS、vWF的mRMA表达情况。 结果：电镜观察示铁颗粒及WP小体位于细胞浆内；MTT比色试验示25ug／mlFe2O3-PLL标记细胞，其生长曲线与未标记细胞的相似；流式细胞分析显示25ug／mlFe2O3-PLL标记细胞未改变其表面标记物(CD34、CD146、VEGFR2)的表达，标记细胞的细胞周期、细胞凋亡与未标记细胞相似；NO、NOS检测分析结果显示未标记细胞与标记后培养1、2、3、5、7天细胞的NO含量、NOS活性间无统计学差异(P>0．05)：激光共聚焦显微镜分析示Fe2O3-PLL标记细胞不改变细胞内外钙离子平衡及细胞膜流动性；未标记细胞、标记后培养1、7天细胞的VEGFR2、eNOS、vWF的mRNA表达量间无统计学差异。 结论：低标记浓度(25ug／ml)的Fe2O3-PLL即可有效标记兔外周血EPCs，其对细胞的增殖、功能、分化等生物学特性无明显影响，可用于进一步的活体示踪实验。 第四部分:兔颈动脉粥样硬化模型的MR成像及内皮祖细胞磁粒子标记后经股动脉插管局部移植、MR示踪的初步实验研究 目的：高脂饮食加球囊扩张右侧颈动脉制作新西兰兔动脉粥样硬化模型，应用1．5T临床应用型磁共振观测动脉粥样硬化形成过程，探讨纳米磁粒子偶联物Fe2O3-PLL标记兔外周血LEPCs，经股动脉插管同种异体移植到模型兔右侧颈动脉局部、活体成像的可行性。 方法：制备Fe2O3-PLL，标记分离纯化后得到的兔外周血EPCs，普鲁士兰染色显示细胞内铁：高脂饮食加球囊扩张右侧颈动脉制作新西兰兔动脉粥样硬化模型，于球囊扩张前及扩张后2、4、8、12周取静脉血检测血脂改变情况，同时进行颈部MR成像及颈动脉病理学检查。同种方法制作模型兔18只，分为标记细胞移植组(n=6)、未标记细胞移植组(n=6)和对照组(n=6)。模型制作6周后，将标记细胞、未标记细胞及等量生理盐水经股动脉插管移植至模型兔右侧颈动脉局部，在移植前、移植后1d、7d、14d应用MR对颈动脉进行活体成像。观察血管管壁及管腔的变化情况，测量颈部血管的对比度噪声比(CNR)及血管腔内信噪比(SNR)，细胞移植后每一时间点进行血管组织切片的普鲁士兰染色。 结果：普鲁士兰染色显示蓝色铁颗粒位于EPCs胞浆内，Fe2O3-PLL对EPCs的标记率接近100％；高脂饮食后第2、4、8、12周血浆胆固醇、甘油三酯水平进行性增加；MR成像显示：与高脂喂养前相比，血管壁在高脂喂养后4周(球囊扩张后3周)时可见增厚，差异具有统计学意义(P<0．001)，血管腔在高脂喂养8周后可见狭窄，有统计学差异(P<0．05)；增厚的血管壁于各成像序列上均呈不均匀高信号，颈部CNR测量结果显示质子密度加权像(PDWI)的CNR最高，最利于颈部血管的显示，血管腔内的SNR测量结果亦显示PDWI的SNR最高，成像质量最好。病理学检测示高脂喂养、球囊损伤后内膜破坏、血管平滑肌增厚，至第12周时，可见典型的粥样斑块形成；与移植前相比，标记细胞移植组、未标记细胞移植组和对照组移植后各时间点的SNR差异均无统计学意义。血管组织的普鲁士兰染色结果显示，只有移植后1d的血局部可见少量蓝染颗粒。 结论：高脂饮食加球囊扩张可成功的制作兔动脉粥样硬化损伤模型，临床应用型1．5TMR可动态观察这一病理过程，与病理检测结果有很好的相关性；在动脉粥样硬化形成过程中移植EPCs不能使其在局部停留。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

文献综述　内皮祖细胞的特性及其在动脉粥样硬化性疾病中的作用

成体干细胞的标记和心血管系统MR分子成像进展

第一部分　兔外周血内皮祖细胞分离、培养及鉴定的实验研究

1材料和方法

2结果

3讨论

4结论

参考文献

第二部分　外周血内皮祖细胞磁粒子标记及MR体外成像研究

1材料与方法

2结果

3讨论

4结论

参考文献

第三部分　Fe2O3-PLL标记内皮祖细胞对细胞生物学特性影响的实验研究

1材料与方法

2结果

3讨论

4结论

参考文献

第四部分　兔劲动脉弱样硬化模型的MR成像及内皮祖细胞磁粒子标记后经股动脉插管局部移植、MR示踪的初步实验研究

1材料与方法

2结果

3讨论

4结论

参考文献

致谢

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