三维DNA芯片结合通用探针连接检测单核苷酸变异的研究

摘要

单核苷酸变异（single nucleotide variatioN,SNV）因其与疾病易感性、药物反应差异性、人类进化及种群多样性等相关而广受关注，虽然传统的检测方法能够实现单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）和点突变位点的准确分型，但是这些方法也都各自存在一些不足之处，而理想的检测方法应该具有高准确度、操作简单、高通量和低成本的特点，因此探索和建立高效且检测成本低的SNV的检测方法仍然十分必要。
　　 三维聚丙烯酰胺凝胶DNA芯片因具有DNA高固定容量、高检测灵敏度、高杂交效率以及均一类液相反应微体系等特点，被越来越多的应用于各种生命科学研究领域，如甲基化检测、SNP研究、DNA序列测定、DNA克隆和抗体检测等。本课题以具有自主知识产权的三维聚丙烯酰胺凝胶DNA芯片为平台，开展新型SNV的检测方法的探索实践，提出了基于通用探针连接的两种新型检测方法。试验结果表明，这两种方法都能给出准确的分型结果，在保持DNA芯片高通量分析优势的同时，将这种优势大大向小样本数目的分析推进，能更灵活的用于探索性研究，同时也为临床样本的检测奠定了基础。
　　 本论文的主要内容如下：
　　 (1)通用探针连接与反向通用探针连接检测方法对DNA合成模板的模拟SNV分型
　　 之前，我们实验室采用双色荧光杂交结合三维聚丙烯酰胺凝胶DNA芯片的方法检测SNV，该方法准确性高且操作简便，但不足的是每检测一个位点就需要一对荧光标记的探针，当分析的样本数目不是很大时（如数百个），探针费用平摊到每个样本的成本就会大大高于其他分析方法，且位点越多分型费用就越高，因此很不经济。为了保持三维聚丙烯酰胺凝胶DNA芯片的高通量分析的优势，并同时降低样本数目不多时的检测成本，我们提出了将三维DNA芯片与通用探针的连接反应相结合的SNV检测方法。初期大量的条件探索实验表明，采用通用探针连接检测和反向通用探针连接检测方法均能成功实现DNA合成模板中的SNV模拟分型，从而验证了这两种方法的可行性，为后续实际样本的SNV分型奠定了良好的基础。
　　 (2)通用探针连接方法检测实际DNA样本中的SNV
　　 通用探针连按检测方法的原理如下：首先，三维聚丙烯酰胺凝胶固定的PCR产物分析模板与测序引物完成杂交，然后，在T4 DNA连接酶的介导下，5’端磷酸化的测序引物与荧光标记的通用探针发生特异性连接反应，识别变异碱基。采用该方法，本研究工作成功检测了基因组DNA的聚合酶链式反应(polymerase chain reactioN,PCR)产物中的SNV，其中包括33个样本的SNP位点rs1800497C/T，83个样本的线粒体点突变位点：C3206T和A5301G。由于通用探针的特殊设计，该方法使用四条通用探针就能够实现所有SNV位点的分型，是一种准确、快速、高通量且低成本的新型检测技术。
　　 (3)反向通用探针连接检测实际DNA样本中的SNV
　　 尽管通用探针连接方法已较大的降低了SNV的检测成本，但是其不足之处是必须针对每个位点设计一条5’端磷酸化的测序引物。为了进一步节约成本，本课题提出了反向通用探针连接方法。在通用探针的3’端标记荧光基团，5’端修饰磷酸根，识别碱基位于5’端的第一个碱基，这种方法只需针对每个位点设计一条普通的测序引物，在DNA连接酶的作用下，由探针的5’端识别碱基信息，进行特异性连接，从而检测出SNV。采用反向通用探针连接技术，准确检测了多个DNA样本的SNV，包括一个SNP位点rs13317C/T，两个线粒体点突变位点：C3206T和A5301G。该方法在保持三维DNA芯片的高通量优势的同时，进一步降低了小样本数目的分型费用，大大拓展了三维DNA芯片的使用范围。

目录

文摘

英文文摘

缩写及术语表

第一章 绪论

1.1 单核苷酸变异

1.1.1 SNV的应用

1.1.2 SNV的基本检测方法

1.2 三维聚丙烯酰胺凝胶DNA芯片

1.2.1 三维凝胶DNA芯片的研究进展

1.2.2 三维聚丙烯酰胺凝胶DNA芯片的制备方法

1.2.3 三维DNA芯片使用中提高信噪比的方法

1.2.4 三维聚丙烯酰胺凝胶DNA芯片的应用

1.3 本课题的研究目的与研究内容

1.3.1 研究目的

1.3.2 研究内容

第二章 通用探针连接方法检测SNV的可行性研究

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 合成模板的单碱基检测

2.3.2 反应条件的优化

2.3.3 合成模板的分型

2.3.4 决定通用探针连接方法检测准确度的因素

2.4 结论

第三章 通用探针连接方法检测PCR产物芯片的SNV

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验材料

3.2.2 实验方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 PCR产物的物理检测

3.3.2 小样本PCR产物的SNV分型

3.3.3 大样本PCR产物的SNV分型

3.3.4 通用探针连接方法较其它传统检测方法的优势

3.3.5 通用探针连接检测方法的不足

3.4 结论

第四章 反向通用探针连接方法对SNV的检测

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 实验材料

4.2.2 实验方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 PCR产物的电泳结果

4.3.2 合成模板的模拟分型

4.3.3 PCR产物中的SNV检测

4.3.4 双色荧光杂交、通用探针连接与反向通用探针连接方法的比较

4.4 结论

第五章 总结与展望

5.1 论文工作的主要内容和研究成果

5.2 后续工作中需要解决的问题

参考文献

附录 主要试剂的配制方法

作者简介

致谢