食品病原微生物快速PCR检测技术研究

摘要

食品安全是一个重大的世界性公共卫生问题，不仅影响到人们的健康，更是关系到国计民生的大事，越来越受到人们的重视，其中细菌性食物中毒是引起食源性疾病的主要因素。传统的细菌检测方法耗时长，操作繁琐，越来越不能满足实际检测的需要。该研究采用Dynabeads(R)磁珠作为捕获磁珠，磁珠与设计好的寡核苷酸特异性探针通过羧基与氨基或链霉亲和素与生物素的反应，形成共价键连接；采用酚-氯仿方法抽提待测样本微生物基因组DNA，在磁珠捕获之前采用限制性内切酶方法切断DNA；偶联了特异性探针的磁珠与模板杂交捕获后进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测结果。本文构建了食源性肠炎沙门氏菌快速PCR检测方法，以期为食品安全生产提供快速检测技术，同时该技术还可用于临床肠道病原微生物快速诊断。
　　本研究首先以肠炎沙门氏菌invA基因为目的基因设计引物及两种长度(20bp、70bp)的特异性探针，5’端进行氨基(NH2-)修饰；通过扩增挑克隆测序验证后，以获取的质粒作为阳性模板：以Dynabeads MyOne Carboxylic Acid作为捕获磁珠；加入EDC后磁珠与寡核苷酸通过羧基与氨基缩合反应，形成共价键连接；偶联了特异性探针的磁珠与模板杂交捕获后进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测结果。将此方法与常规PCR进行了灵敏度的对比，结果显示捕获探针特异性好；长度为20bp探针的反应灵敏度要低于常规PCR的检测；长度为70bp的捕获探针检测灵敏度高于20bp探针的灵敏度，且高于常规PCR反应，为6.05×10-5ng/μl。随着捕获探针长度的增加，PCR反应的灵敏度随之增加但重复性不好，所以提出新的实验方案。
　　其次选择肠炎沙门氏菌质粒作为研究方法的调试模板，仍以沙门氏菌invA基因为靶基因，采用PCR扩增的方法制作了生物素标记的DNA探针，长度为171bp。成功制备探针后利用链霉亲和素磁珠与生物素之间的特异性结合捕获模板DNA，磁性分离后将连接在磁珠上的模板进行PCR扩增，最后经琼脂糖凝胶电泳检测，并将该方法成功应用于鸭肉微生物模拟样本的检测。结果显示本研究建立的方法特异性强及敏感性高，灵敏度为6.05×10-7ng/μl，与常规PCR方法相比高100倍。人工污染模拟样本鸭肉微生物基因组DNA经限制性内切酶DdeI酶切后，应用本研究建立的方法检测，敏感性未发生变化。
　　该方法检测结果准确可靠；成本低、易制作；捕获效率高、特异性好；操作简单、灵敏度高；避免了繁琐的步骤，检测时间只需28h；去除了食品中其他复杂成分对PCR的影响；PCR扩增后无需扫描仪等大型仪器的检测，只需经简单的琼脂糖凝胶电泳检测即可，实现了高通量快速检测。此方法只是本研究在食源性肠炎沙门氏菌中的初步应用，还可以用于其他食品致病菌的检测，一次可以检测多种致病菌，从而使之具有更大的检测范围，实用性更强，为PCR快速检测方法的简化以及普及与应用奠定了基础。