人源抗-CTGF单链抗体的制备及其在抑制肺成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化中作用的研究

摘要

背景：结缔组织生长因子(CTGF)可以促进细胞外基质的产生和沉积，是导致肺纤维化的关键因子。阻断CTGF可能是治疗肺纤维化的有效方法。
　　目的：制备抗结缔组织生长因子单链抗体(scFv)，研究其住抑制肺纤维化形成和发展中的作用，探索其对肺成纤维细胞表型转化的影响以及可能的信号通路，初步阐明其作用机制。
　　方法：使用定点突变试剂盒将前期构建的质粒pET32a-TrxA-His-scFv-His突变为pET32a-TrxA-scFv-His并将之转化到E.coli.BL21(DE3)感受态细胞中，IPTG诱导表达融合蛋白TrxA-scFv-His，经过凝血酶酶切及两次镍柱亲和层析得到抗CTGF单链抗体蛋白，SDS-PAGE电泳检测其纯度，ELISA检验其免疫学活性。使用TGF-β1与制备的scFv共同干预人胚肺成纤维细胞，通过RT-PCR、免疫荧光实验及Western Blot技术检测各组人胚肿成纤维细胞中的α-SMA的表达水平。Western Blot检测scFv对HELF的D-Akt的影响。
　　结果：SDS-PAGE电泳显示经过亲和层析得到的抗CTGF单链抗体纯度在95％以上，ELISA实验表明抗其能够CTGF特异性结合，RT-PCR、Western Blot及免疫荧光实验显示TGF-β1对人胚肺成纤维细胞的α-SMA上调表达作用能够被抗CTGF单链抗体所抑制。Western Blot结果显示抗CTGF单链抗体可抑制人胚肺成纤维细胞的Akt的磷酸化。
　　结论：我们制备了纯度较高的、能够与CTGF特异性结合的抗CTGF单链抗体，这种单链抗体能够抑制人胚肺成纤维细胞向肌成纤维细胞表彤转换，这种效应的机制之一可能是通过抑制Akt磷酸化实现的。